| |
| |  |
Odkrycie wirusa HIV w kr≤tkim czasie po pojawieniu siΩ nie znanej wcze£niej choroby, poznanie jego budowy i metod hodowli, pozwoli│o na opracowanie laboratoryjnych metod diagnozowanie tych zaka┐e±. Mia│o to istotne znaczenie praktyczne, gdy┐ objawy zaka┐enia HIV mog╣ nie wystΩpowaµ przez wiele lat. Podstaw╣ tej diagnostyki s╣ badania przesiewowe, wykrywaj╣ce przeciwcia│a anty-HIV, bΩd╣ce odpowiedzi╣ uk│adu immunologicznego na zaka┐enie tym wirusem Rozpoznanie zaka┐enia opiera siΩ w praktyce na stwierdzeniu obecno£ci we krwi swoistych przeciwcia│ skierowanych przeciw wirusowi HIV. S╣ one dowodem czynnego zaka┐enia. Testy u┐ywane w laboratoriach, do£µ proste w wykonaniu, dostarczaj╣ wiarygodnych wynik≤w. Pozwalaj╣ wykryµ r≤wnie┐ zaka┐enia HIV przebiegaj╣ce bezobjawowo, czyli bez ┐adnych zmian klinicznych. Przeciwcia│a anty-HIV pojawiaj╣ siΩ po kilku tygodniach od zaka┐enia, zazwyczaj nie wcze£niej ni┐ po 6-8 tygodniach. Je£li po 3 miesi╣cach od prawdopodobnego nara┐enia na zaka┐enie wynik badania nie potwierdza obecno£ci przeciwcia│, z zasady uznaje siΩ, ┐e do zaka┐enia nie dosz│o. Ujemny wynik testu wykonany wcze£niej nie jest miarodajny i nie pozwala wykluczyµ zaka┐enia. Niekiedy uzasadnione jest powtarzanie tych bada± w okresie p≤ƒniejszym. Do wykrywania przeciwcia│ anty-HIV u┐ywa siΩ powszechnie test≤w immunoenzymatycznych (ELISA, EIA). Obowi╣zuje zasada, aby w razie dodatniego wyniku testu wykonaµ go t╣ sam╣ metod╣ ponownie. Nawet je£li obydwa dostarcz╣ dodatnich wynik≤w, nie wolno rozpoznaµ zaka┐enia HIV. W ka┐dym takim przypadku wykonuje siΩ jeszcze tzw. test potwierdzenia (Western Blot) w wyznaczonych o£rodkach referencyjnych. Mimo i┐ dostΩpne obecnie testy EIA tylko wyj╣tkowo dostarczaj╣ fa│szywie dodatnich wynik≤w, dopiero dodatni wynik badania testem Western Blot upowa┐nia do powiadomienia pacjenta o tym, ┐e jest zaka┐ony wirusem HIV. Zaka┐enie nie jest r≤wnoznaczne z chorob╣. Szacuje siΩ, ┐e AIDS wyst╣pi u oko│o po│owy nosicieli wirusa w ci╣gu 10 lat od momentu zaka┐enia. Poniewa┐ nie tylko chorzy, lecz r≤wnie┐ nosiciele HIV mog╣ byµ ƒr≤d│em zaka┐enia dla innych os≤b, wczesne rozpoznanie tych zaka┐e± odgrywa istotn╣ rolΩ w zapobieganiu rozprzestrzeniania siΩ HIV. / Poradnik (+) /
W testach anty-HIV znalaz│y zastosowanie r≤┐ne rodzaje antygen≤w. Testy, w rozwoju historycznym, otrzymywa│y okre£lenia numeryczne okre£laj╣ce ich generacjΩ. Testy I generacji zawiera│y antygeny bΩd╣ce lizatami cz╣stek wirusa wyhodowanego na odpowiednich liniach kom≤rkowych. Poniewa┐ w procesie przygotowywania tak uzyskiwanych antygen≤w wirusowych mo┐liwe by│o zanieczyszczenie bia│kami pochodz╣cymi z kom≤rek, na kt≤rych hodowano wirusa, uzyskiwano wyniki fa│szywie dodatnie. Testy II generacji zawiera│y antygeny HIV w│a£ciwe bia│kom wirusa, kt≤rych ekspresj╣ uzyskano metod╣ rekombinacji genetycznych (najczΩ£ciej w kom≤rkach bakteryjnych), lub stosowano syntetyczne oligopeptydy z│o┐one z 1540 aminokwas≤w. Testy III generacji zawieraj╣ ww. antygeny z t╣ r≤┐nic╣, i┐ stosuje siΩ w nich wariant testu ELISA, zwany metod╣ "kanapkow╣" (patrz ni┐ej). Testy II i III generacji charakteryzuje wysoki stopie± standaryzacji, precyzyjny dob≤r epitop≤w i wysokiego stopnia czysto£µ antygen≤w, kt≤rych liczba wynosi od 2 do 3.
/ Poradnik dla stomatolog≤w /
| | | Zgodnie z przyjΩtymi oznaczeniami testy te nosz╣ nazwΩ "enzyme immunoassays" (EIA) lub "enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA). S╣ uwa┐ane za tani i efektywny spos≤b przeprowadzania bada± przesiewowych. ELISA jako metoda wykrywania anty-HIV mo┐e byµ skonstruowana w r≤┐ny spos≤b; opracowano r≤┐ne warianty tego testu do wykrywania anty-HIV. NajczΩstsze zastosowanie, w r≤┐nych modyfikacjach, znalaz│y testy po£rednie ("indirect assay") oraz metoda kompetycyjna ("competitive assay"), a ostatnio metoda "kanapkowa". W odmianach tych antygeny wykrywaj╣ce s╣ umieszczone w fazie sta│ej. Przeciwcia│a znajduj╣ce siΩ w badanej surowicy u1egaj╣ zwi╣zaniu z antygenem testowym. W metodzie po£redniej kompleks antygen-przeciwcia│o jest wykrywany po dodaniu przeciwcia│ przeciwko ludzkiej anty-IgG sprzΩ┐onej z enzymem (np. fosfataz╣ alkaliczn╣ lub peroksydaz╣ chrzanow╣), tak ┐e po dodaniu odpowiedniego substratu reakcja enzymatyczna powoduje zmianΩ zabarwienia o natΩ┐eniu proporcjonalnym do liczby anty-HIV. W metodzie kompetetycyjnej badana surowice dodaje sie r≤wnoczesnie z anty-HIV znakowanym enzymem. W okresie inkubacji anty-HIV znajdujace sie w surowicy pacjenta wsp≤lzawodnicza ze znakowanymi przeciwcialami testowymi o ogranicza liczbe miejsc wiazania antygenu umieszczonego w fazie stalej. W przypadku, gdy w badanej surowicy nie ma anty-HIV, wszystkie miejsca wi╣┐╣ce antygenu zajmuj╣ anty-HIV sprzΩ┐one z enzymem, co daje maksymaln╣ absorbancjΩ. Je┐eli natomiast w badanej surowicy s╣ anty-HIV, wi╣┐╣ siΩ one z antygenem w proporcji zale┐nej od liczby anty-HIV, przez co reakcja barwna ma mniejsze nasilenie, ani┐eli w pr≤bce negatywnej. Tak wiΩc, inaczej ani┐eli w reakcji po£redniej, intensywno£µ barwy w metodzie kompetycyjnej jest odwrotnie proporcjonalna do ilo£ci anty-HIV obecnych w dodatniej pr≤bce. W metodzie "kanapkowej" antygen op│aszczony w fazie sta│ej, wi╣┐e anty-HIV z badanej pr≤bki. W nastΩpnym etapie dodaje siΩ podobny antygen zwi╣zany z enzymem. W testach III generacji koniugat jest swoi£cie wi╣zany przez przeciwcia│a anty-HIV zar≤wno klasy IgG, jak i IgM. Daje to mo┐liwo£µ wcze£niejszego wykrywania zaka┐e± HIV-1+2, £rednio o 4-10 dni. ZwiΩkszy│a siΩ przez to czu│o£µ bada±. Szczeg≤│owe opisy techniki stosowanej przez r≤┐nych producent≤w znajduj╣ siΩ w instrukcjach za│╣czanych do zestaw≤w. Testy wykrywajace anty-HIV-2 uzyskaly licencje FDA w 1990r. Od test≤w w kierunku anty-HIV-1 r≤znia sie rodzajem zastosowanych antygen≤w. Podobnie jak dla test≤w anty-HIV-1, stosuje sie tu r≤zne techniki diagnostyczne. Zaproponowano algorytm diagnostyczny, majacy na celu identyfikacje rodzaju wirusa. Jezeli po przeprowadzeniu testu przesiewowego, wynik jest dodatni, a w tescie uzupelniajacym , np. WB, ujemny lub nie okreslony, nalezy przeprowadzic test w kierunku anty-HIV-2. Opracowano takze testy uzupelniajace dla identyfikacji anty-HIV-2 (patrz nizej). Jednak┐e najbardziej wygodnym i popularnym rozwi╣zaniem sta│y siΩ testy kombinowane: anty-HIV-1+2 zawieraj╣ce odpowiednie zestawy antygen≤w. Przez to po│╣czenie nie straci│y one czu│o£ci w wykrywaniu przeciwcia│ przeciwko obu wirusom. Ostatnio w wykrywaniu anty-HIV znalaz│y tak┐e zastosowanie systemy automatyczne o bardzo skomplikowanych uk│adach elektronicznych z rozbudowan╣ pamiΩci╣ skonstruowane przez r≤┐nych producent≤w. S╣ one wyposa┐one w bardzo szerokie mo┐liwo£ci diagnostyczne tak┐e z innego zakresu, zar≤wno zaka┐e±, jak i hormon≤w etc. Mog╣ mieµ zastosowanie w laboratorium o ma│ej, jak i bardzo du┐ej liczbie bada±. Czas wykonania analizy, w zale┐no£ci od systemu oraz prac przygotowawczych pomiΩdzy kolejnymi procedurami, wynosi od 30 minut do 3,5 godziny. / Poradnik dla stomatolog≤w /  |  | ELISA - test immunoenzymatyczny
Wykrywa obecno£µ przeciwcia│ anty-HIV | P│ytka ELISA ujawniaj╣ca ujemne (jasne) i dodatnie (czerowne) wyniki testu w kierunku HIV |
|---|
/ Zaka┐enie HIV u kobiet /
| | | Metoda aglutynacjiS╣ to testy │atwiejsze do przeprowadzenia, ani┐eli ELISA. Nie wymagaj╣ specjalnego oprzyrz╣dowania. Znalaz│y zastosowanie w badaniach populacji z wysokimi wskaƒnikami seropozytywno£ci. Jako no£niki antygen≤w stosuje siΩ ┐e1atynΩ, lateks, heterologiczne i autologiczne erytrocyty. S╣ to testy o znacznej czu│o£ci, lecz mniejszej swoisto£ci, wzglΩdnie szybkie, z odczytem bezpo£rednim, u┐yteczne w temperaturze otoczenia od +18 do + 30 oC. Test aglutynacyjny z zastosowaniem lateksu, na kt≤rym jest op│aszczony antygen HIV, ma czu│o£µ rzΩdu 95,2% i swoisto£µ 96,1% w por≤wnaniu z testem ELISA. Czas wykonania badania wynosi 10 minut, lecz odczyt nie jest zbyt │atwy. Test aglutynacji biernej ma ma│e zastosowanie poza Ameryk╣ úaci±sk╣. W por≤wnaniu z poprzednim ma jeszcze mniejsz╣ swoisto£µ i czu│o£µ. / Poradnik dla stomatolog≤w /
| | | W te£cie aglutynacji cz╣steczkowej ("particle agglutination assay") przeciwcia│a przeciwko ludzkiej IgG (faza sta│a) wychwytuj╣ IgG (tak┐e anty-HIV) w badanej pr≤bce. NastΩpnie dodaje siΩ zawiesiny cz╣stek ┐elatyny op│aszczonych antygenem HIV. Je┐eli w badanej pr≤bce s╣ anty-HIV - cz╣stki przylegaj╣ do powierzchni p│ytki (adherencja), na kt≤rej znajduje siΩ kompleks anty-IgG/anty-HIV. Jest to test nieco mniej czu│y i swoisty ani┐eli test ELISA, jednak┐e r≤┐nice nie s╣ tu zbyt du┐e, a czu│o£µ mo┐e byµ nawet wy┐sza we wczesnych okresach serokonwersji. Test ten zastosowano tak┐e do bada± moczu. / Poradnik dla stomatolog≤w /
| | | Antygen (rekombinat, peptyd syntetyczny) jest umieszczany w postaci ma│ych kropek ("dot "), zawieraj╣cych du┐e stΩ┐enie HIV Ag (mo┐e to byµ HIV-1 obok HIV-2), na b│onie nitrocelulozowej. Odczyt nastΩpuje na podstawie zmiany barwy utworzonego kompleksu Ag/Ab. Test jest szybki (3-10 min) i nadaje siΩ do zastosowania w≤wczas, gdy chodzi o uzyskanie wyniku w bardzo kr≤tkim czasie. / Poradnik dla stomatolog≤w /
| | | Inne szybkie testyS╣ to testy, kt≤rych czas wykonania wynosi od 10 do 15 minut. Antygeny HIV s╣ umieszczone na b│onach, a zasada testu jest oparta na metodzie ELISA. Wykrycie kompleks≤w immunologicznych po reakcji z ludzk╣ anty-IgG polega na odczycie precypitacji, widocznej na b│onie w postaci odpowiednio zabarwionego pr╣┐ka - przez por≤wnanie z kontrol╣. Czu│o£µ wynosi od 95% do 99,8%, a swoisto£µ od 95% do 99%. / Poradnik dla stomatolog≤w /
| | | Inne testy przesiewoweSystem Abbotta IMX wykrywa anty-HIV za pomoc╣ fluoroscencyjnej metody wykrywania kompleksu antygen-przeciwcia│o. Jest to metoda podobna do testu ELISA; czas wykonania wynosi 15 min. Zastosowano tak┐e (SimpliRed test) autologiczne krwinki czerwone wykazuj╣ce aglutynacjΩ (badanie na pe│nej krwi) w przypadku obecno£ci anty-HIV. Odczynnik zawiera przeciwcia│a przeciwko antygenom grupowym erytrocyt≤w w kompleksie z syntetycznym peptydem gp 41. / Poradnik dla stomatolog≤w /
| | | Testy serologiczne potwierdzaj╣ce (badania weyfikacyjne)Na podstawie bada± przeprowadzonych na du┐ej liczbie surowic - pochodz╣cych od os≤b o ma│ym ryzyku zaka┐enia - wyniki fa│szywie dodatnie w testach kombinowanych, ELISA i WB stwierdzono w proporcji mniejszej ani┐eli 1:100 000. Istotnym problemem diagnostycznym s╣ tzw. wyniki "nieokre£lone". Tego rodzaju wzorce (np. reakcja tylko z p17 lub tylko z p24) mo┐e wystΩpowaµ w oko│o 15% bada± z u┐yciem WB. Je┐eli tego typu wzorce nie zmieniaj╣ siΩ przez wiele miesiΩcy, nie oznacza to zaka┐enia HIV. U os≤b tych nie wykazano obecno£ci prowirusa HIV przy zastosowaniu metody PCR. Okres obserwacji przekracza│ w wy┐ej cytowanych badaniach p≤│ roku. Na tyle okre£la siΩ konieczny okres nadzoru, w kt≤rym trzeba powt≤rzyµ test. Je┐eli nie pojawiaj╣ siΩ dodatkowe pasma pozytywne, prawdopodobie±stwo zaka┐enia jest minimalne. W materiale polskim ujemne wyniki bada± weryfikacyjnych w te£cie Western-blot, a wiΩc wy│╣czenie zaka┐e± HIV, mimo dodatnich wynik≤w w testach przesiewowych, uzyskano w 12,1% przy drugiej generacji i 14,8% przy trzeciej generacji. Odsetki wynik≤w nie rozstrzygniΩtych wynosi│y odpowiednio 23,2% i 11,8% (w opracowaniu tym - "Serologiczna diagnostyka zaka┐e± HIV" Z. Selib≤rka - │╣czna liczba bada± w r≤┐nych grupach w zale┐no£ci od ryzyka zaka┐enia wynosi│a 1265). / Poradnik dla stomatolog≤w /
| | | Western-blotJest najczΩ£ciej stosowanym testem uzupe│niaj╣cym. Wykorzystuje siΩ w nim mo┐liwo£µ okre£lenia reaktywno£ci antygen≤w HIV umieszczonych oddzielnie na pasku nitrocelulozowym lub na innym pod│o┐u, w celu uwidocznienia reakcji z anty-HIV w badanej surowicy. Bia│ka HIV s╣ u│o┐one wg ich ciΩ┐aru cz╣steczkowego (od gp160 do p17). Po zadaniu badan╣ surowicΩ i wyp│ukaniu nie zwi╣zanego materia│u, paski inkubuje siΩ z kozi╣ surowic╣ zawieraj╣c╣ przeciwcia│a przeciwko ludzkiej IgG sprzΩ┐one z enzymem (peroksydaza chrzanowa lub fosfataza alkaliczna). Reakcja pozytywna, po dodaniu odpowiedniego substratu, uwidacznia siΩ w postaci zabarwionych pasemek. W te£cie tym, jako pierwsze po zaka┐eniu ujawniaj╣ siΩ anty-HIV przeciwko bia│ku kodowanemu przez region gag; zanikaj╣ one w okresie wyst╣pienia objaw≤w klinicznych. Natomiast anty-HIV przeciwko glikoproteinie otoczki oraz bia│ku przezb│onowemu wykrywa siΩ we wszystkich fazach zaka┐enia. Mo┐na tak┐e stwierdziµ anty-HIV przeciwko produktom genu pol, a rzadziej - tat, vif, nef i innym bia│kom gag.  Stosuje siΩ r≤┐ne kryteria interpretacyjne. Niekt≤re z nich s╣ bardzo restrykcyjne, jak np. firmy Ortho/DuPont, gdzie - aby wynik uznaµ za dodatni - reakcja musi dotyczyµ p24, p31 gp41 lub gp120/gp160. îwiatowa Organizacja Zdrowia ustali│a swe kryteria w zakresie HIV-1 na dwa wyniki dodatnie odno£nie do bia│ek env z (lub bez) dodatnim wynikiem z gag lub pol, a dla HIV-2 r≤wnie┐ dwa wyniki dodatnie z bia│kami otoczki z (lub bez) gag lub pol. / Poradnik dla stomatolog≤w /
Wyniki testu Western-Blot (wg zdjΩcia):
- niepewny
- s│abo dodatni
- wyraƒnie dodatni
/ Zaka┐enie HIV u kobiet /
| | | Line immunoassay (LIA) r≤┐ni siΩ tym od testu WB, i┐ antygeny nie s╣ umieszczone na pasku testowym w technice rozdzia│u elektroforetycznego, lecz nak│adane w postaci rozdzielonych pr╣┐k≤w. S╣ to antygeny rekombinowane i/lub peptydy syntetyczne. W te£cie tym mo┐na umie£ciµ optymalne ilo£ci antygen≤w, co u│atwia odczyt (wg wzorc≤w) i interpretacjΩ. Mo┐na r≤wnie┐ w uk│adzie wykrywaj╣cym uwzglΩdniµ antygeny HIV-1 i HIV-2. Test nadaje siΩ do oznacze± w surowicy, plazmie i pe│nej krwi. / Poradnik dla stomatolog≤w /
| | | Test imunofluorescencyjnyJest ta±szy od testu WB, lecz wymaga do£wiadczonego oka w ocenie wynik≤w. Zaka┐one HIV limfocyty utrwala siΩ na szkie│ku podstawowym wraz z kontrol╣ w postaci limfocyt≤w nie zaka┐onych. SurowicΩ badan╣ inkubuje siΩ z preparatami kom≤rkowymi, a nastΩpnie z fluorescein╣ sprzΩ┐on╣ z przeciwcia│ami przeciwko ludzkiej IgG. Anty-HIV wi╣┐╣ siΩ z antygenami wirusa w zaka┐onych limfocytach, co daje mo┐liwo£µ policzenia odsetk≤w kom≤rek wykazuj╣cych fluorescencjΩ i jej typ. / Poradnik dla stomatolog≤w /
| | | Limfocyty hoduje siΩ w medium zawieraj╣cym aminokwasy znakowane pierwiastkami radioaktywnymi. Lizaty z tych kom≤rek inkubuje siΩ z badan╣ surowic╣. Po niezbΩdnych procedurach po£rednich - odczyt polega na wykrywaniu kompleks≤w immunologicznych zawieraj╣cych pierwiastek promieniotw≤rczy. / Poradnik dla stomatolog≤w /
| | | Zmodyfikowany test WB zawiera w swym sk│adzie liczne antygeny HIV-1 oraz jeden antygen swoisty dla HIV-2 (gp36 lub gp41). Test INNO-LIA zawiera natomiast trzy rekombinowane bia│ka HIV-1 (p24, p17 i p31), dwa syntetyczne peptydy (gp41) oraz jeden antygen HIV-2 (gp36). Kombinowany test uzupe│niaj╣cy "MATRIX" (Abbott) jest oparty na systemie p≤│automatycznym z wykorzystaniem metody plamkowej ("dot-blot"). / Poradnik dla stomatolog≤w /
| | | S╣ to liczne metody umo┐liwiaj╣ce hodowlΩ wirusa z r≤┐nego materia│u, badanie obecno£ci jego produkt≤w antygenowych oraz znajdowanie kwasu nukleinowego w p│ynach i w tkankach. Konsekwencj╣ tych bada± jest okre£lenie fazy zaka┐enia, a przede wszystkim mo┐liwo£µ oceny nasilenia replikacji wirusa zar≤wno w tkankach (np. w wΩz│ach ch│onnych), jak i w plazmie (wiremia). Na tym polu dokona│ siΩ w ostatnich latach znaczny postΩp. Wykrycie wiremii umo┐liwia wczesne rozpoznanie zaka┐enia u noworodk≤w urodzonych z matek HIV+. Swoisto£µ i czu│o£µ pomiar≤w ilo£ciowych zalety od ilo£ci materia│u wirusowego (faza zaka┐enia), jak i rodzaju testu, kt≤rego nie nale┐y traktowaµ jako badanie rutynowe. / Poradnik dla stomatolog≤w /
| | | HodowlΩ wirusa prowadzi siΩ z p│yn≤w ustrojowych (przede wszystkim z plazmy) oraz z kom≤rek wra┐liwych na zaka┐enie HIV. Czas trwania hodowli wynosi od 2 do 6 tygodni. Wyniki zale┐╣ od wielu czynnik≤w, takich jak rodzaj materia│u (£wie┐y, mro┐ony), rodzaj zastosowanego czynnika przeciwkrzepliwego, a tak┐e techniki hodowli. Niezale┐nie od zastosowanej metody, czΩsto£µ dodatnich hodowli oraz miano wirusa wzrastaj╣ wraz z postΩpem choroby, zmniejszaniem siΩ liczby limfocyt≤w CD4 oraz wykrywalno£ci HIV Ag. CzΩsto£µ dodatnich hodowli wynosi od 56% do 100%, przy czym prawie wszyscy chorzy z ARC lub AIDS wykazuj╣ wyniki dodatnie, natomiast nie u wszystkich bezobjawowych nosicieli udaje siΩ uzyskaµ pozytywny wynik. Od czasu pierwszych hodowli HIV z kom≤rek z krwi obwodowej udoskonalono metodΩ, kt≤ra obecnie umo┐liwia wykrycie HIV u przesz│o 90% os≤b HIV+. Jako wskaƒnik zaka┐enia stosuje siΩ tu pomiar p24 w nads╣czu I wykrywanie aktywno£ci rewertazy. / Poradnik dla stomatolog≤w /
| | | Klasyczn╣ metod╣ jest polimerazowa reakcja │a±cuchowa, nazywana tak┐e reakcj╣ │a±cuchow╣ polimerazy (PCR). Natomiast hybrydyzacja in situ, stosowana do wykrywania materia│u genetycznego wirusa w kom≤rkach i w tkankach przy zastosowaniu sond genetycznych, jest w por≤wnaniu z PCR o wiele mniej czu│a. 0 ile przy u┐yciu pierwszej z nich mo┐na by│o wykryµ od 1:100 do 1:1000 limfocyt≤w CD4 zaka┐onych HIV, o tyle metod╣ hybrydyzacji tylko 1:10 000-1:100 000. PCR wymaga przeprowadzenia trzech etap≤w (niezbΩdne jest zastosowanie odpowiednio dobranych, wzorcowych odcink≤w poszukiwanego RNA lub DNA, tzw. prymer≤w): ekstrakcji, amplifikacji i uwidocznienia wykrytego kwasu nukleinowego. PCR dla oznaczenia obecno£ci RNA wirusowego wymaga konwersji RNA w cDNA, czego dokonuje siΩ przy zastosowaniu odwrotnej transkryptazy, amplifikacja natomiast odbywa siΩ przez u┐ycie odpowiedniej polimerazy DNA. PCR znalaz│a zastosowanie w wielu sytuacjach, takich jak wykrywanie kwasu nukleinowego wirusa w plazmie, kom≤rkach, p│ynach ustrojowych, u noworodk≤w urodzonych z zaka┐onych matek, a tak┐e u os≤b seronegatywnych, znajduj╣cych siΩ w grupach wysokiego ryzyka zaka┐enia HIV. Metoda ta jest stale udoskonalana, m.in. dziΩki stosowaniu sekwencji wewnΩtrznych, niezbΩdnych do bada± i1o£ciowych (zewnΩtrzne wystarczaj╣ w badaniach ilo£ciowych). Konieczno£µ bardziej precyzyjnych oznacze± ilo£ciowych stymulowa│a badaczy do wprowadzenia nowych rozwi╣za± 1aboratoryjnych. W zakresie PCR, s╣ to takie modyfikacje, jak PCR in situ i PCR kompetycyjna. W pierwszej z wymienionych, amplifikacji dokonuje siΩ wewn╣trz odpowiednio spreparowanych, wyizolowanych kom≤rkach. DziΩki niej bardzo dok│adnie okre£la siΩ odsetki kom≤rek zawieraj╣cych materia│ genetyczny HIV, kt≤rych jest dziesiΩciokrotnie wiΩcej, ani┐eli opisywano to przy zastosowaniu poprzednio u┐ywanych technik. Opracowano tak┐e metodΩ kombinowan╣: PCR in situ z cytometri╣ przep│ywow╣. W drugiej z wy┐ej wymienionych DNA HIV-1 oznacza siΩ ilo£ciowo poprzez kompetycjΩ z fragmentem DNA zmutowanego HIV-1 o znanym stΩ┐eniu (odpowiednie rozcie±czenia). Metoda nie wymagaj╣ca ekstrakcji i amplifikacji enzymatycznej to test amplifikacji sygna│u rozga│Ωzionego DNA (proponowana nazwa polska), branched DNA signal amplification assay (w skr≤cie bDNA; "Quantiplex HIV-RNA", Chiron Corporation). Test jest oparty na zasadzie hybrydyzacji syntetycznych oligonukleotyd≤w komplementarnych do poszukiwanych sekwencji genomu HIV. Utworzony kompleks hybrydyzuje z syntetycznymi, rozga│Ωzionymi cz╣steczkami DNA (bDNA). Powsta│y kompleks tr≤jsk│adnikowy inkubuje siΩ z substratem o w│a£ciwo£ciach chemiluminescencyjnych, co umo┐liwia pomiar nasilenia reakcji. Inny test, naprzemiennej amplifikacji sekwencji kwas≤w nukleinowych (proponowana nazwa polska) nucleic acid sequence-based amplification (NASBA, Organon-Teknika) polega na do│╣czeniu do RNA znajduj╣cego siΩ w badanej pr≤bce, prymera zawieraj╣cego promotor T 7, a nastΩpnie syntezy komplementarnego DNA za pomoc╣ rewertazy wirusa mieloblastozy ptasiej (AMV-RT). Pierwotny │a±cuch RNA degraduje siΩ RN-az╣ H. Na matrycy otrzymanego cDNA, AMV-RT syntetyzuje komplementarny │a±cuch DNA. Polimeraza T 7-RNA syntetyzuje antysensown╣ niµ RNA. Produkty reakcji mo┐na wykryµ metod╣ standardow╣ (pr╣┐ki na ┐elu w £wietle / Poradnik dla stomatolog≤w /
| | | ⌐ 1998 SONAR | |
|
|
