ELEKTROFOREZA - WĘDRÓWKA W ŻELU.
Elektroforeza - technika stosowana przy rozdziale , analizie i oczyszczaniu kwasów nukleinowych i białek.
DNA i RNA maj± ładunek ujemny i zgodnie z tym ładunkiem , nadawanym przez grupy fosforanowe , migruj± w polu elektrycznym w kierunku anody. Szybko¶ć migracji zależy od wielko¶ci i kształtu cz±steczki.
Schemat postępowania jest następuj±cy : żel ulega zestaleniu w formie cienkiej płytki na podstawce tzw. saneczkach wraz z zanurzonym specjalnego typu grzebieniem , który następnie wyci±ga się.
W zastygłym żelu znajduje się szereg dołków , do których wprowadzane s± próbki DNA oraz z reguły tzw. standard czyli mieszanina cz±steczek o znanych masach dzięki czemu możliwa będzie póĽniej kalibracja żelu. Przed naniesieniem na żel próbki musz± być odpowiednio przygotowane : dodawany jest barwnik , który informuje nas póĽniej jak daleko zaszły najszybsze cz±steczki (co jest niezbędne ponieważ DNA w żelu nie widać) oraz zwi±zek interkaluj±cy - bromek etydyny , który fluoryzuje w ¶wietle UV co pozwoli nam na zlokalizowanie pr±żków.
Minimalna ilo¶ć DNA , któr± widać na żelu w postaci pr±żka to 20 ng. Ilo¶ć DNA w pr±żku nie powinna przekraczać 200 ng ponieważ obserwuje się przeładowanie kieszonki. Żel umieszczony zostaje w specjalnym aparacie do elektroforezy i zalewany buforem przewodz±cym pr±d. Podł±czony zostaje do zasilacza generuj±cego pr±d o stałym i okre¶lonym napięciu i natężeniu. Jako¶ć rozdziału fragmentów DNA zmniejsza się w miarę zwiększania napięcia w czasie elektroforezy. Dla otrzymania optymalnej jako¶ci stosuje się napięcie nie większe niż 5V na 1cm długo¶ci żelu.
Kalibracja wielko¶ci fragmentów cz±steczek w żelu opiera się na zasadzie , że liniowe cz±steczki DNA migruj± w żelu agarozowym z prędko¶ci± odwrotnie proporcjonaln± do logarytmu dziesiętnego ich masy cz±steczkowej wyrażonej w Daltonach lub w tysi±cach par zasad czyli kb. Kalibracja żelu polega na wykre¶leniu krzywej zależno¶ci odległo¶ci przebytej w czasie elektroforezy przez poszczególne fragmenty od logarytmu masy cz±steczkowej.
Elektroforezę można przeprowadzać w żelach natywnych lub denaturuj±cych.
1. Żele agarozowe.
Metoda szybka , prosta , powszechnie stosowana. Zdolno¶ć rozdzielcza zależy od wielko¶ci porów w żelu , których rozmiary s± zdeterminowane przez stężenie agarozy. Żeli bardziej stężonych tj. 1,4-2,0 % używa się do rozdziału cz±steczek mniejszych (0,5-2,0 kb). Żele mniej stężone 0,5-0,7 % stosuje się do rozdziału cz±steczek większych (10-20 kb i więcej).
Zalet± może być niekiedy fakt , że podczas elektroforezy możliwe jest rozdzielenie cz±steczek o tej samej wielko¶ci ale zróżnicowanych pod względem kształtu. Doskonałym przykładem jest rozdział trzech różnych form plazmidu : CCC (ang. covalently closed circle) , liniowej i OC (ang. open circle). Pierwsza najszybciej wędruje w żelu , druga nieco wolniej , trzecia najwolniej.
2. Żele akrylamidowe.
Powstaj± przez polimeryzacje monomerów akrylamidu w długie łańcuchy z wytworzeniem wi±zań poprzecznych przez bisakrylamid. Można regulować sieciowanie poprzez manipulację proporcjami stężeń akrylamidu do bisakrylamidu. Do zaj¶cia reakcji niezbędna jest obecno¶ć odpowiedniego katalizatora (PERS - nadsiarczan potasowy) i zwi±zku inicjuj±cego reakcję (TEMED). Żele te stosuje się przy rozdziale fragmentów o wielko¶ci od kilku par zasad (20% poliakrylamid) do tysi±ca par zasad (3% poliakrylamid) a także przy rozdziale jednoniciowych cz±steczek DNA np. do sekwencjonowania.
3. Żele denaturuj±ce.
Ponieważ szybko¶ć migracji w żelu jednoniciowych cz±steczek , zależy nie tylko od ich wielko¶ci i ładunku ale także w dużym stopniu od ich struktury przestrzennej (w przypadku dwuniciowych cz±steczek DNA nie ma to większego znaczenia) aby dokładnie okre¶lić ich wielko¶ć należy weliminować różnice w szybko¶ci migracji wywołane różn± konformacj± cz±steczki. Jest to szczególnie ważne w przypadku jednoniciowego RNA , które tworzy miejscowe struktury dwuniciowe. W tym wła¶nie celu stosuje się żele denaturuj±ce agarozowe lub poliakrylamidowe. Najczę¶ciej używanymi czynnikami denaturuj±cymi s± : formaldehyd i glioksal w żelach agarozowych (przy analizie preparatów RNA) lub mocznik w żelach poliakrylamidowych (przy analizie jednoniciowych fragmentów DNA).
4. Elektroforeza w polu pulsacyjnym.
Stosowana do rozdzielenia dużych cz±steczek DNA - od 2.104 do 107 bp czyli od 20 kb do 10 Mb. Można w ten sposób rozdzielić całe chromosomy np. drożdżowe. Pole elektryczne jest wł±czane i wył±czane w krótkich odstępach czasu. Kiedy pole elektryczne jest wł±czone cz±steczki migruj± zgodnie ze swoj± wielko¶ci± a gdy zostaje wył±czone maj± tendencję do relaksacji i zwijania w przypadkowe pętle. Czas wymagany do relaksacji jest wprost proporcjonalny do długo¶ci cz±steczki. Następnie kierunek pola elektrycznego jest zmieniany o 90 lub 180 stopni w stosunku do poprzedniego. Dłuższe cz±steczki zaczynaj± poruszać się wolniej niż krótsze. Powtarzaj±ce się zmiany kierunku pola stopniowo powoduj± rozdzielenie.