ZNAKOWANIE W CELU WIZUALIZACJI WYNIKU

ZNAKOWANIE W CELU WIZUALIZACJI WYNIKU

Wiele metod biologii molekularnej opiera się na wykorzystaniu wyznakowanych cz±steczek kwasów nukleinowych. Dobra sonda powinna mieć wysok± aktywno¶ć , odpowiedni± czysto¶ć i specyficzno¶ć. Najpowszechniej wykorzystywane do znakowania s± cz±steczki nukleotydów, w których jeden z atomów zast±piony został izotopem radioaktywnym. Aktywno¶ć specyficzna zależy od proporcji wł±czonych nukleotydów radioaktywnych do normalnych. Krótszy okres półtrwania izotopu również powoduje zwiększenie aktywno¶ci specyficznej. Najczę¶ciej stosowane s± dwa izotopy : fosfor ³²P (wł±czany w pozycji a lub g cz±steczki trifosforanu nukleotydu) oraz siarka ³⁵S (wł±czana w miejsce atomu tlenu odpowiedniej reszty fosforanowej - a lub g). Fosforu radioaktywnego używa się gdy wymagane jest uzyskanie sondy o wysokiej aktywno¶ci co zapewnia duż± czuło¶ć i krótki czas detekcji. Podstawowym zastosowaniem siarki jest sekwencjonowanie DNA a także badanie metabolizmu białek.

Najczę¶ciej używane radioizotopy.
Radioizotop	Czas półtrwania	Energia emitowanych cz±stek (MeV)	Specyficzna aktywno¶ć wyznakowanych składników (mCi/mmol)
Tryt	12,35 lat	0,0186	10²-10⁵
Węgiel - 14	5730 lat	0,156	1 - 10²
Siarka - 35	87,5 dnia	0,167	1 - 10⁶
Fosfor - 33	25,5 dnia	0,248	10 - 10⁴
Fosfor - 32	14,3 dnia	1,709	10 - 10⁵
* MeV = 10⁶ elektronowoltów. Powyżej podana maksymalna energia.
^{# mCi (miliCurie) - miara liczby rozpadów na jednostkę czasu. 1 mCi = 2,2^.10⁹ rozpadów na minutę.}

W zależno¶ci od konkretnego zastosowania stosuje się różne metody znakowania DNA :

Nick translation - DNaza I wprowadza do cz±steczki jednoniciowe pęknięcia (nick). Polimeraza I dzięki swojej aktywno¶ci 5`-3` egzonukleazy usuwa nukleotydy przed sob± a za sob± dobudowywuje nowe wł±czaj±c między innymi również nukleotydy radioaktywne. W ten sposób przesuwa niejako miejsce pęknięcia. Wydajno¶ć inkorporacji wynosi około 50%. Metoda ta daje najlepsze wyniki przy znakowaniu całych plazmidów a nie jest raczej zalecana do fragmentów liniowych.

Random priming - najczęstsza , oparta jest na hybrydyzacji oligonukleotydów (6 do 9 nukleotydów) o przypadkowej sekwencji do DNA , który ma być wyznakowany. Następnie polimeraza Klenowa (fragment polimerazy DNA I nie posiadaj±cy aktywno¶ci egzonukleolitycznej 5`-3`) dosyntetyzowuje komplementarn± nić DNA poczynaj±c od 3` OH końca przył±czonego startera. W mieszaninie reakcyjnej znajduj± się także radioaktywne nukleotydy wł±czane stopniowo do nowo syntetyzowanej nici. Długo¶ć znakowanych fragmentów nie wpływa na wydajno¶ć reakcji. Można w ten sposób uzyskać sondę o wysokiej aktywno¶ci. Metoda jest doskonała zarówno do znakowania całych plazmidów jak i liniowych fragmentów.

Znakowanie DNA na końcach.

- Znakowanie 5` końca.

W tej metodzie używa się kinazy polinukleotydowej faga T4 , która przenosi grupę fosforanow± z pozycji g ATP na DNA lub RNA zawieraj±ce grupę hydroksylow± na 5` końcu.

Ponieważ normalnie cz±steczki DNA zawieraj± grupę fosforanow± na 5` końcu należy przed znakowaniem poddać je działaniu alkalicznej fosfatazy , która spowoduje jej usunięcie. Metoda najczę¶ciej stosowana do znakowania syntetycznych oligonukleotydów.

- Znakowanie 3` końca.

Terminalna transferaza doł±cza deoksyrybonukleotydy na 3` końcu. Nie wymaga matrycy. Substratem dla tego enzymu może być zarówno jednoniciowe jak i dwuniciowe DNA.

- Wypełnianie lepkich końców. W tej metodzie używa się fragmentu Klenowa , który dobudowuje brakuj±ce na 3` końcu nukleotydy w cz±steczkach strawionych enzymami restrykcyjnymi tworz±cymi lepkie końce 5`. Wydajno¶ć inkorporacji sięga niekiedy nawet 90%.

Po znakowaniu niezbędne jest oddzielenie niewł±czonych radioaktywnych dNTP , które mogłyby ujemnie wpływać na jako¶ć hybrydyzacji daj±c zbyt wysokie tło czyli zmniejszaj±c specyficzno¶ć reakcji. Rozdzielenie uzyskuje się przez s±czenie na kolumienkach ze specjalnym złożem , które zatrzymuje zwi±zki drobnocz±steczkowe przepuszczaj±c makrocz±steczki.

Ilo¶ciowe oznaczenie wyznakowania osi±ga się przez pomiar aktywno¶ci sondy. Jest on możliwy za pomoc± dwóch urz±dzeń : licznika Geigera i licznika scyntylacyjnego . Zliczaj± one zarejestrowane rozpady promieniotwórcze w jednostce czasu. Jednostk± podstawow± jest cps - (counts per second) zliczenie na sekundę lub dpm - (disintegrations per minute) liczba rozpadów promieniotwórczych na minutę.

Wykrywanie wizualne wyznakowanych cz±steczek w celu zlokalizowania pr±żka , który z sond± zhybrydyzował jest możliwe dzięki autoradiografii. Starsz± metod± jest poddanie na¶wietlaniu kliszy pokrytej emulsj± fotograficzn± czuł± na napromieniowanie w specjalnych kasetach. Klisza położona na filtr ulega zaczernieniu w miejscu hybrydyzacji z sond±. Kasetę tak± przechowuje się przez pewnien czas , odwrotnie proporcjonalny do aktywno¶ci sondy , w temperaturze - 70°C. Niska temperatura sprzyja ostro¶ci pr±żków. Następnie klisza jest wywoływana. Nowsz± metod± jest ekspozycja filtru w innych kasetach. Jest tu niezbędne specjalne urz±dzenie tzw. phosphoimager sprzężony z komputerem , który umożliwia zeskanowanie powierzchni kasety i obróbkę uzyskanych w ten sposób danych. Przy pomocy programu komputerowego Image Quant jeste¶my w stanie oszacować nawet intensywno¶ć zaczernienia.

TECHNIKA WESTERN BLOT

ELEKTROFOREZA - WĘDRÓWKA W ŻELU