Izolacja z żelu jest niezbędnym etapem w szeregu do¶wiadczeń. Jest konieczna gdy po rozdziale pragniemy wykorzystać do dalszej pracy pewn± okre¶lon± frakcję materiału lokuj±cego się w odpowiednim pr±żku.

Istnieje wiele metod odzyskiwania DNA z żeli jednak żadna z nich nie jest pozbawiona wad.

Istotne problemy przy izolacji to :

- obecno¶ć inhibitorów reakcji enzymatycznych np. obecne w agarozie zanieczyszczenia w postaci polisacharydów , które hamuj± aktywno¶ć enzymów używanych przy dalszej obróbce klonowanego DNA

- niezbyt duża skuteczno¶ć odzyskiwania dużych fragmentów DNA ponieważ wydajno¶ć izolowania jest funkcj± ciężaru cz±steczkowego tych fragmentów , za wielko¶ć graniczn± dla dobrej izolacji przyjmuje się długo¶ć 5 kb

- im mniejsza ilo¶ć DNA na żelu tym mniejsza wydajno¶ć jego odzyskiwania , izolacja staje się nieskuteczna przy ilo¶ciach mniejszych niż 500 ng

- nie ma możliwo¶ci izolacji jednocze¶nie kilku fragmentów o różnej długo¶ci.

Polega na przyczepieniu się migruj±cego DNA do umieszczonej w żelu membrany z DEAE-celuloz± , któr± następnie odpłukuje się z zanieczyszczeń buforem o niskiej sile jonowej a potem eluuje z niej DNA buforem o wysokiej sile jonowej. Należy pamiętać , że z membran nie podlega elucji jednoniciowe DNA oraz fragmenty powyżej 15 kb.

Najefektywniejsza do izolacji dużych fragmentów DNA - powyżej 5 kb. Po odpowiednim rozdzieleniu wycina się konkretny pr±żek DNA , umieszcza w woreczku dializacyjnym , który wkłada się do aparatu do elektroforezy i prowadzi j± przez jaki¶ czas po czym na krótko odwraca się bieguny i prowadzi elektroforezę przez minutę co pozwala na uwolnienie DNA ze ¶cian woreczka. Woreczek dializacyjny zostaje przepłukany odpowiednim buforem i po dodaniu kilku specjalnych odczynników i wirowaniu otrzymujemy preparat DNA.

Jest to bardzo szybka metoda izolacji. Tak jak poprzednio po elektroforezie zostaje z żelu wycięty konkretny pr±żek. Fragment żelu umieszczony w probówce , na dnie której znajduje się niewielka ilo¶ć silikonowej szklanej waty , zamraża się w ciekłym azocie (freeze) a następnie wkłada się jedn± probówkę w drug± po zrobieniu w tej pierwszej niewielkiego otworku na dnie. Kolejnym etapem jest wirowanie (sqeeze). Uzyskany w ten sposób bufor poddaje się jeszcze kilku zabiegom wytr±cania i wirowania , po których otrzymujemy wyizolowane DNA.

ELEKTROFOREZA - WĘDRÓWKA W ŻELU

SEKWENCJONOWANIE - Sˇ JUŻ DO TEGO MASZYNY

Webmaster