TECHNIKA WESTERN BLOT

TECHNIKA WESTERN BLOT

(białko-przeciwciało) - wi±zanie przeciwciała w celu identyfikacji okre¶lonego białka.

Etapy :

1. Przygotowanie ekstraktów komórkowych.

Metody stosowane przy izolacji i oczyszczaniu białek s± bardzo różnorodne a ich wybór zależy od wła¶ciwo¶ci danego białka.

2. Rozdział białek w żelach poliakrylamidowych. W zależno¶ci od zastosowanego układu można uzyskać rozdział polipeptydów stosownie do różnych wła¶ciwo¶ci fizykochemicznych. Przyjmuje się , że elektroforeza w obecno¶ci SDS (dodecylosiarczan sodowy) - detergent - frakcjonuje białka zależnie od ich masy czyli zarazem długo¶ci łańcucha polipeptydowego. Eliminuje efekt różnicowania pod względem kształtu. SDS powoduje denaturację białka , dysocjację podjednostek (rozbija wi±zania niekowalencyjne) i opłaszczenie. Około1,4 gr SDS wi±że się z 1 gr białka. Ten typ elektroforezy jest najczę¶ciej stosowany i może być użyty jako metoda analityczna lub stanowić element szeregu dalszych badań. Złożem , w którym następuje rozdział jest żel poliakrylamidowy. Z reguły do rozdziału białek używana jest szczególna wersja elektroforezy tzw. elektroforeza nieci±gła , która umożliwia maksymalne wykorzystanie zdolno¶ci rozdzielczych tej metody. W praktyce oznacza to , że zarówno żel składa się jakby z dwóch warstw (żel rozdzielaj±cy i zatężaj±cy różni±ce się składem procentowym) jak również bufor do elektroforezy inny jest w górnym inny w dolnym zbiorniku aparatu do elektroforezy. Próbki nakładane na żel mog± mieć stosunkowo duż± objęto¶ć ponieważ w czasie przechodzenia przez górn± warstwę żelu zostaj± zagęszczone do w±skiego pasma aby w dolnym żelu ulec rozdzieleniu na pojedyncze , ostre pr±żki. Dzięki temu , że frakcjonowanie zachodzi w zależno¶ci od długo¶ci łańcucha polipeptydowego jeste¶my w stanie ustalić masę cz±steczkow± danego białka przez porównywanie z odpowiednimi standardami o znanych masach , z dokładno¶ci± do 5-10%.

3. Renaturacja.

Inkubacja z odpowiednim buforem.

4. Transfer białek z żelu na membranę nitrocelulozow±.

Z reguły elektrotransfer.

5. Immunoblotting.

Jednym z niebezpieczeństw jest to , że białka zaadsorbowane do nitrocelulozy mog± mieć nieco zmieniony układ przestrzenny aminokwasów a ponieważ rozdzielane s± w żelu w formie zdenaturowanej a następnie musz± ulec renaturacji , mog± w ogóle nie przyjmować swojej natywnej postaci.
a. Zablokowanie miejsc niespecyficznych.
b. Inkubacja ze specyficznymi dla poszukiwanego białka przeciwciałami.
c. Inkubacja z odczynnikiem używanym do detekcji.

Najczę¶ciej s± to II (drugorzędowe) przeciwciała czyli przeciwciała , dla których antygenem jest przeciwciało specyficzne. II przeciwciała zwi±zane s± z barwnikami fluorescencyjnymi , cz±stkami złota lub enzymami. Systemy detekcyjne musz± być proste i czułe. Można wykryć za ich pomoc± nawet 10^-9 do 10^-12 gr białka. II przeciwciała mog± być skoniugowane z enzymem , który zmienia kolor substratu podczas reakcji np. z AP - alkaliczn± fosfataz± (w zależno¶ci od użytego substratu utworzony zwi±zek jest ciemno niebieski lub purpurowy) lub z HRP - peroksydaz± szczurz± (utlenienie odpowiednich substratów prowadzi do powstawania ciemnego str±tu w miejscu reakcji). Innym systemem detekcji jest awidyna lub streptawidyna skoniugowana z enzymem (AP lub HRP). Awidyna i streptawidyna silnie wi±ż± się z biotyn±. I przeciwciała znakuje się biotyn± a zamiast II przeciwciał do detekcji używa się awidyny lub streptawidyny skoniugowanej z enzymem. Ponieważ jedna cz±steczka awidyny lub streptawidyny zwi±zana jest z kilkoma cz±steczkami enzymu system detekcji jest bardziej czuły niż w przypadku użycia przeciwciał.

Następny system to tzw. system NIP. Stworzony aby ograniczyć ilo¶ć niespecyficznych reakcji II przeciwciał. I przeciwciała znakuje się nitrojodofenolem (NIP) , II przeciwciała skoniugowane z enzymem s± skierowane przeciwko NIP. Ponieważ NIP jest zwi±zkiem drobnocz±steczkowym reakcja przeciwciał jest bardzo specyficzna. Kolejny rodzaj to systemy nieenzymatyczne. Na przykład II przeciwciała wyznakowane koloidalnym złotem lub radioaktywnie (¹²⁵I). W pierwszym przypadku uzyskuje się bezpo¶rednie uwidocznienie reakcji , w drugim detekcja wymaga autoradiografii.

TECHNIKA NORTHERN

ZNAKOWANIE W CELU WIZUALIZACJI WYNIKU