home *** CD-ROM | disk | FTP | other *** search
/ The Pier Shareware 6 / The_Pier_Shareware_Number_6_(The_Pier_Exchange)_(1995).iso / 026 / med9408e.zip / M9480858.TXT < prev    next >
Text File  |  1994-09-05  |  3KB  |  50 lines
  1.        Document 0858
  2.  DOCN  M9480858
  3.  TI    Sensitivity and application of a new method for isolating purified
  4.        compartmentalized HIV-1 unintegrated and integrated DNA.
  5.  DT    9410
  6.  AU    Bush CE; Golembieski A; Donovan RM; Baxa D; Markowitz N; Saravolatz LD;
  7.        Henry Ford Hospital, Detroit, MI.
  8.  SO    Abstr Gen Meet Am Soc Microbiol. 1994;94:483 (abstract no. T-4). Unique
  9.        Identifier : AIDSLINE ASM94/94313087
  10.  AB    Measurement of the relative amounts of HIV unintegrated DNA (uDNA) and
  11.        integrated DNA (iDNA) is a promising marker of therapeutic efficacy. The
  12.        Hirt procedure for isolating total uDNA requires multiple extractions
  13.        leading to DNA loss. We developed a novel column-based method for the
  14.        isolation of cytoplasmic and nuclear uDNA fractions and the proviral
  15.        iDNA from HIV-1. Aliquots of counted peripheral blood mononuclear cells
  16.        (PBMCs) from 10 patients on antiretrovirals with CD4 counts > 200 were
  17.        processed using the column or Hirt methods. The column method
  18.        resuspended PBMCs in lysis buffer with the cytoplasmic fraction purified
  19.        by centrifugation and ion exchange chromatography. The nuclear uDNA
  20.        fraction was purified by base and detergent lysis followed by
  21.        centrifugation and chromatography. The Hirt procedure lysed PBMCs with
  22.        SDS and iDNA was separated from uDNA by high salt and centrifugation.
  23.        The two fractions were digested and extracted multiple times. The amount
  24.        of iDNA from both methods was quantified by measuring the OD260. The
  25.        amount of HIV DNA in the uDNA and iDNA fractions was determined using
  26.        quantitative PCR. The uDNA fractions were tested for iDNA contamination
  27.        by RAS specific PCR. The nuclear uDNA fraction was tested for
  28.        cytoplasmic uDNA contamination using mitochondrial DNA specific PCR. All
  29.        10 of the patients had uDNA in both fractions. Seven of the patients had
  30.        more uDNA in the nuclear fraction than the cytoplasmic fraction, 2 had
  31.        about the same amount and 1 had more in the cytoplasm. There was an
  32.        average of 10% uDNA in the cytoplasm and 26% in the nucleus. Two of the
  33.        patients had recently switched antiretroviral therapy and their total
  34.        uDNA levels dropped from 45% to 16% and 17% to 7%, respectively, after 4
  35.        weeks on new therapy. The new method was found to recover approximately
  36.        50 X more u/iDNA than the Hirt procedure. This new method has proven to
  37.        be rapid, reliable and directly PCR compatible. We are using it to
  38.        characterize the uDNA in the separated fractions and to monitor copy
  39.        number changes in patients as therapy starts or changes.
  40.  DE    Acquired Immunodeficiency Syndrome/*DRUG THERAPY/IMMUNOLOGY/
  41.        MICROBIOLOGY  Cell Nucleus/MICROBIOLOGY  Cytoplasm/MICROBIOLOGY  DNA,
  42.        Viral/ANALYSIS/*BLOOD/GENETICS  Human  HIV-1/GENETICS/*ISOLATION & PURIF
  43.        Lymphocytes/IMMUNOLOGY/*MICROBIOLOGY  Polymerase Chain Reaction/*METHODS
  44.        Sensitivity and Specificity  T4 Lymphocytes/IMMUNOLOGY  *Virus
  45.        Integration  MEETING ABSTRACT
  46.  
  47.        SOURCE: National Library of Medicine.  NOTICE: This material may be
  48.        protected by Copyright Law (Title 17, U.S.Code).
  49.  
  50.