home *** CD-ROM | disk | FTP | other *** search
/ NetNews Usenet Archive 1993 #3 / NN_1993_3.iso / spool / bionet / molbio / methdsr / 3221 < prev    next >
Encoding:
Internet Message Format  |  1993-01-28  |  1.7 KB
  1. Path: sparky!uunet!biosci!CLVAX1.CL.MSU.EDU!preissj
  2. From: preissj@CLVAX1.CL.MSU.EDU ("J Preiss--Seq Anal")
  3. Newsgroups: bionet.molbio.methds-reagnts
  4. Subject: re hybridization problems
  5. Message-ID: <9301271843.AA02929@net.bio.net>
  6. Date: 27 Jan 93 18:39:00 GMT
  7. Sender: daemon@net.bio.net
  8. Distribution: bionet
  9. Lines: 36
  10.  
  11. Hi Chriss
  12.  
  13.     Well, you did not give very much information in your request for help.
  14. Since I really can't trouble shoot your method very well, I will just give you
  15. mine.  I use 1.5x SSPE, 1.0% SDS, and 0.5% blotto (Carnation instant milk, 
  16. made fresh) for my hybe and prehybe for both northern and southern work.
  17. That's it.  Nothing else.  I used to use sheard DNA, but have since left that
  18. out with no ill effect.  I specifically do not like any of the "hybridization
  19. enhancers" like denharts, formamide, and dextran.  I find all of them to give
  20. background problems in genomic southerns where it counts most.  I hybredize
  21. at 55 to 65 degrees.  Tm is defined by the following formula in this mix:
  22.  
  23. Tm=16.6(log[Na+])+0.41(%GC)+81.5+500/(probe length bp)
  24.  
  25. [Na+] = 0.15 for 1x SSC        log 0.15 = -0.824
  26.       = 0.015 for 0.1x SSC    log 0.015 = -1.824
  27.  
  28. probe length from standard oligonucleotide procedures = about 250 bp 
  29.     (regardless of the template length)
  30.  
  31. If GC is assumed to be about 50%, then:
  32.     Tm = 86 C    in 1.0x SSC
  33.        = 70 C     in 0.1x SSC
  34.  
  35.     These numbers are for the wash conditions, which I do in 0.1% to 
  36. 1.0% SDS and 0.1x SSC to 1.0x SSC at 55 C.  I find that going below 55
  37. gives higher background, while changing salt gives varried stringency 
  38. without background.
  39.  
  40.     Good Luck and feel free to write back for more info.
  41.  
  42.         Dr. Leonard N. Bloksberg
  43.         PreissJ@clvax1.cl.msu.edu
  44.         Dept. of Biochemistry
  45.         Michigan State University
  46.  
  47.