home *** CD-ROM | disk | FTP | other *** search
/ NetNews Usenet Archive 1992 #27 / NN_1992_27.iso / spool / bionet / molbio / methdsr / 2554 < prev    next >
Encoding:
Text File  |  1992-11-16  |  2.4 KB  |  55 lines
  1. Newsgroups: bionet.molbio.methds-reagnts
  2. Path: sparky!uunet!spool.mu.edu!wupost!emory!sol.ctr.columbia.edu!destroyer!fmsrl7!lynx!carina.unm.edu!bhjelle
  3. From: bhjelle@carina.unm.edu ()
  4. Subject: Re: PCR Mutagenesis
  5. Message-ID: <bhjq#pp@lynx.unm.edu>
  6. Date: Mon, 16 Nov 92 14:43:46 GMT
  7. Organization: University of New Mexico, Albuquerque
  8. References: <mxdq3j#@lynx.unm.edu> <Bxntyw.Fqu@usenet.ucs.indiana.edu>
  9. Lines: 44
  10.  
  11. In article <Bxntyw.Fqu@usenet.ucs.indiana.edu> jgraham@bronze.ucs.indiana.edu (the End) writes:
  12. >In <mxdq3j#@lynx.unm.edu> bhjelle@carina.unm.edu () writes:
  13. >
  14. >>I encountered an impressively high level of mutagenesis (14 
  15. >>errors out of 411bp) in amplifying a segment of DNA from
  16. >>a plasmid clone. All mutations involved T or A in some
  17. >>manner. 11 were point mutations (transitions and
  18. >>transversions), but 3 were 1 bp insertions or deletions.
  19. >
  20. >Very interesting and disturbing. We routinely generate templates for in vitro
  21. >transcription via PCR using a protocol (Higuchi et al. NAR 16 (15) p.7351) 
  22. >recomended by a well-known colleague.
  23. >
  24. >This procedure uses plasmid targets at 200-400 ng/ rxn. with dNTPs at 0.175 mM
  25. >and a mere 16 cycles. The low cycle number is suggested in order to 
  26. >reduce the chance of errors generated by Taq. I obtain about 1 to 5 ug of
  27. >500 bp fragments from target plasmids around 3 Kb.
  28. >
  29. >In the NAR paper describing this technique, Krummel and associates report that
  30. >they have not seen a single base change in preparing 10 different transcription
  31. >templates in the 500 bp size range (p. 7359 line 14).
  32. >
  33. >Are you using a significantly lower dNTP concentration ?
  34. >
  35. I used 0.8mM of (each) dNTP, 4mM MgCl2 (these primers were optimized
  36. at those concentrations) and 250 pmol of primer (each) in TV=125ul.
  37. I got a high yield (5ug) of PCR product, but in back-calculating,
  38. it seems that I would have gotten 250ug of product if all
  39. dNTPs in solution were really "used up" in the reaction. So
  40. I have a hard time believing that Taq ran out of dNTPs during
  41. PCR. However, I did use 45 cycles for convenience.
  42.  
  43. At the suggestion of the P-E rep, I lowered the dNTPs to 200uM,
  44. the Mg to 1.5mM, and did 10, 15, and 20 cycles to regenerate
  45. PCR product. These parameters should all be lower to generate
  46. less mutations. Also, I previously used 12.5U of AmpliTaq but
  47. now lowered that to 2.5U. I used 1ug of plasmid template(!).
  48.  
  49. Hopefully I will be able to get back with results showing lower
  50. levels of mutations.
  51.  
  52. Brian
  53.  
  54.  
  55.