TECHNIKA NORTHERN

(DNA-RNA) - hybrydyzacja DNA w celu identyfikacji

okre¶lonego fragmentu RNA.

Etapy :

1. Izolacja i oczyszczanie RNA z komórek i tkanek.

Typowa komórka eukariotyczna zawiera około 10^-5 mg RNA. 80-85% stanowi± rybosomalne RNA (28S , 18S , 5S). Pozostałe 10-15% to różne rodzaje małocz±steczkowego RNA (tRNA , snRNA i in.). Poszczególne klasy RNA maj± okre¶lon± wielko¶ć i można je izolować w stosunkowo czystej formie za pomoc± technik takich jak elektroforeza , wirowanie w gradiencie gęsto¶ci czy chromatografia jonowymienna. mRNA stanowi 1-5% całkowitej ilo¶ci RNA w komórce.

Komórki wszystkich organizmów zawieraj± rybonukleazy - enzymy bior±ce udział w różnych procesach zwi±zanych z metabolizmem RNA. Aby otrzymać niezdegradowany RNA wymagany jest czynnik inaktywuj±cy RNazy np. DEPC (dietylopirowęglan). Dodaje się go do wszystkich odczynników. Ponadto szkło i sprzęt , który ma bezpo¶redni kontakt z preparatem musi być wysterylizowany w odpowiedni sposób ponieważ RNazy wytrzymuj± gotowanie i autoklawowanie. Jest to ochrona przed egzogennymi RNazami. Poprzez inkubację preparatu z proteinaz± K , traktowanie tiocyjanianem guanidyny , który denaturuje białka czy merkaptoetanolem , który redukuje mostki dwusiarczkowe chroni się preparat przed RNazami endogennymi. Poza tym procedura izolacji RNA jest do¶ć podobna do izolacji DNA.

Bardzo często interesuje nas tylko jeden rodzaj RNA , mianowicie mRNA. Od reszty oddziela się go metod± chromatografii powinowatwa (kolumnowej). Jak wiadomo mRNA ma 3` końcu ma ogon poliadenylowy. Wykorzystujemy tu komplementarno¶ć A=T. Wewn±trz kolumny znajduje się złoże (celuloza , sefaroza) z przył±czonymi na powierzchni odcinkami poli-T. Przez kolumnę przepuszczany jest roztwór całkowitego RNA. Adsorbcji ulegn± tylko mRNA. Inne rodzaje RNA przepłyn± przez kolumnę. Następnie po przeprowadzeniu przez kolumnę specjalnego buforu powoduj±cego odł±czenie mRNA od złoża , otrzymujemy u wylotu spływaj±cy roztwór oczyszczonego mRNA.

2. Elektroforeza RNA w żelach.

Z uwagi na siln± tendencję RNA do tworzenia skomplikowanych struktur drugo- i trzeciorzędowych , które w znacz±cy sposób mog± wpływać na migrację cz±steczek w żelu , powoduj±c tym samym rozdział uzależniony nie tylko od wielko¶ci (czego chemy unikn±ć) elektroforeza prowadzona jest w warunkach denaturuj±cych. Najczę¶ciej do tego celu stosuje się mocznik , formaldehyd , formamid lub ¶rodki , które powoduj± odwracaln± chemicznie modyfikację znosz±c± odziaływania prowadz±ce do wytwarzania struktur przestrzennych jak np. roztwór glioksalu. Elektroforeza może być przeprowadzana w żelach agarozowych lub akrylamidowych.

3. Przeniesienie RNA na filtr (Northern blot).

Technika nie różni się zasadniczo od Southern blot.

4. Hybrydyzacja z sond± i odpłukiwanie.

Aby nie narażać RNA na wysokie temperatury stosuje się w roztworze prehybrydyzacyjnym i hybrydyzacyjnym formamid co pozwala zredukować temperaturę do 42°C. Warunki te s± odpowiednie dla hybrydyzacji kwasów o pełnej homologii. W samej procedurze nie ma znacz±cych różnic w porównaniu z poprzedni± technik±.

5. Autoradiografia. Możliwa jest ilo¶ciowa analiza RNA , co znajduje zastosowanie np. przy porównywaniu ilo¶ci poszczególnych mRNA w komórce w różnych warunkach.

TECHNIKA SOUTHERN

TECHNIKA WESTERN BLOT

Webmaster