TECHNIKA SOUTHERN

(DNA-DNA) - hybrydyzacja DNA w celu identyfikacji okre¶lonego fragmentu DNA.

Etapy :

1. Izolacja i oczyszczanie DNA z komórek lub tkanek.
Jeżeli musimy wyizolować DNA z tkanki lub organizmu pierwszym etapem będzie homogenizacja czyli roztarcie na jednolit± masę. Nie jest to konieczne gdy materiałem s± komórki w roztworze np. bakterie w pożywce czy krew. Następne etapy s± na ogół do¶ć podobne. Obejmuj± cykl dodawania różnych roztworów (np. lizozymu - enzymu niszcz±cego ¶ciany komórkowe w przypadku bakterii , detergentów destabilizuj±cych błony komórkowe itp.) , wielokrotnego wirowania a także je¶li zachodzi potrzeba podczyszczania preparatu z białek (np. denaturacja przy użyciu fenolu) i RNA (np. wytr±canie octanem amonu i trawienie RNaz±).

2. Trawienie DNA odpowiednimi restryktazami.

3. Rozdział elektroforetyczny fragmentów DNA według wielko¶ci i ich denaturacja in situ. Po rozdziale na żelu DNA zostaje zdenaturowany pod wpływem NaOH a następnie poddaje się go działaniu roztworu neutralizuj±cego o pH 7,4.

4. Przeniesienie fragmentów DNA z żelu na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy z zachowaniem ich charakterystycznego rozmieszczenia. Umożliwia to siła ss±ca bibuły przy transferze kapilarnym. Możliwy jest także elektrotransfer. Następnie DNA zostaje zwi±zany z filtrem przez zapiekanie w 80°C lub przez na¶wietlanie UV.

5. Hybrydyzacja z sond±.
a. Prehybrydyzacja - polega na moczeniu filtru w odpowiednim roztworze , którego składniki blokuj± miejsca mog±ce zwi±zać kwasy nukleinowe na filtrze. Nylon i nitroceluloza , z których produkuje się filtry maj± wysokie powinowactwo do jednoniciowego DNA czy RNA. Po przeniesieniu badanego materiału jest to już cecha niekorzystna. W celu zminimalizowania tła wynikaj±cego z hybrydyzacji sondy do losowych cz±steczek DNA lub RNA dodaje się również niehomologiczne DNA no¶nikowe. Od tego etapu uzależniona jest czuło¶ć i specyficzno¶ć eksperymentu. Eliminuje niespecyficzne tło. Warunki prehybrydyzacji - stężenie soli , temperatura - s± takie same jak wła¶ciwej hybrydyzacji.
b. Wła¶ciwa hybrydyzacja - w tym wła¶nie etapie wyznakowana sonda wi±że się z unieruchomionymi na filtrze kwasami nukleinowymi. Dobranie odpowiednich warunków zapewnia specyficzno¶ć czyli wi±zanie sondy tylko z okre¶lonymi fragmentami oraz czuło¶ć. W przypadku gdy mamy 100% lub do¶ć wysok± homologię stosujemy ostrzejsze warunki : wyższ± temperaturę (65°C) , mniejsze stężenie soli , czasami dodatek formamidu. Gdy homologia jest czę¶ciowa , wymagane s± mniej ostre warunki : niższa temperatura (55°C) , wyższe stężenie soli. Sondę przed dodaniem należy zawsze zdenaturować w wysokiej temperaturze ponieważ musi być ona w postaci jednoniciowej , co umożliwi jej zwi±zanie na filtrze.
c. Płukanie filtru - pozwala na usunięcie niezhybrydyzowanej sondy co jest warunkiem specyficznego obrazu hybrydyzacji.

6. Ustalenie położenia fragmentów , do których zhybrydyzowała sonda z użyciem autoradiografii , reakcji barwnych lub fluorescencji.

RÓŻNE TECHNIKI CZYLI TRZY ŁYKI PRAKTYKI

TECHNIKA NORTHERN

Webmaster