SEKWENCJONOWANIE - Sí JU» DO TEGO MASZYNY.

Sekwencjonowanie - metoda , dziΩki kt≤rej mo┐liwe jest ustalenie sekwencji czyli okre╢lenie kolejno╢ci nukleotyd≤w. Jeden z etap≤w analizy genu. Na podstawie sekwencji istnieje mo┐liwo╢µ przewidzenia kolejno╢ci aminokwas≤w w bia│ku , kt≤re jest kodowane przez dany gen.

S▒ dwie metody sekwencjonowania :

- Enzymatyczna - metoda Sangera

Na jednoniciowej matrycy syntetyzuje siΩ in vitro DNA. Syteza przebiega od radioaktywnego , oligonukleotydowego startera komplementarnego do 3` ko±ca matrycy. ReakcjΩ wykonuje siΩ r≤wnolegle w czterech prob≤wkach , w kt≤rych opr≤cz kompletu deoksytrifosforan≤w nukleotyd≤w (dATP , dCTP , dTTP , dGTP) dodana jest niewielka ilo╢µ jednego z nich w postaci dideoksytrifosforanu nukleotydu , co uniemo┐liwia kontynuowanie reakcji w momencie w│▒czenia takiego nukleotydu w syntetyzowany │a±cuch , poniewa┐ brakuje wtedy grupy hydroksylowej na 3` ko±cu.

Synteza zostaje zahamowana losowo - powstaje mieszanina fragment≤w o r≤┐nej d│ugo╢ci.

Produkty reakcji poddawane s▒ elektroforezie w czterech r≤wnoleg│ych ╢cie┐kach na ┐elu poliakrylamidowym. Pozwala to na ustalenie sekwencji nici komplementarnej do badanej.

- Chemiczna - metoda Maxama-Gilberta

Jest to metoda praktycznie ju┐ nie stosowana.

Polega na degradacji wyznakowanych na 5` ko±cu cz▒steczek DNA zwi▒zkami chemicznymi przecinaj▒cymi specyficznie wi▒zania fosfodiestrowe za nukleotydem odpowiadaj▒cym okre╢lonej zasadzie azotowej. Wynikiem reakcji jest zbi≤r fragment≤w DNA o r≤┐nej d│ugo╢ci co spowodowane jest takim doborem warunk≤w , ┐e w poszczeg≤lnych cz▒steczkach przecinane jest tylko jedno lub dwa wi▒zania. Fragmenty z czterech niezale┐nych reakcji (dGTP , dGTP i dATP , dCTP , dCTP i dTTP) rozdziela siΩ elektroforetycznie po czym poddaje autoradiografii. Pr▒┐ki na autoradiogramie odpowiadaj▒ fragmentom DNA posiadaj▒cym na ko±cu 5` znakowany fosfor a na ko±cu 3` okre╢lon▒ zasadΩ.

Obydwie metody pozwalaj▒ na odczytanie sekwencji oko│o 400 do 700 nukleotyd≤w w jednym do╢wiadczeniu. Je╢li sekwencjonujemy d│u┐szy odcinek nale┐y go poci▒µ enzymem restrykcyjnym i ustalaµ sekwencjΩ ka┐dego fragmentu osobno.

IZOLACJA Z »ELU CZYLI JAK ODZYSKA╞ DNA

PCR

Webmaster