ELEKTROFOREZA - W╩DR╙WKA W »ELU.

Elektroforeza - technika stosowana przy rozdziale , analizie i oczyszczaniu kwas≤w nukleinowych i bia│ek.

DNA i RNA maj▒ │adunek ujemny i zgodnie z tym │adunkiem , nadawanym przez grupy fosforanowe , migruj▒ w polu elektrycznym w kierunku anody. Szybko╢µ migracji zale┐y od wielko╢ci i kszta│tu cz▒steczki.

Schemat postΩpowania jest nastΩpuj▒cy : ┐el ulega zestaleniu w formie cienkiej p│ytki na podstawce tzw. saneczkach wraz z zanurzonym specjalnego typu grzebieniem , kt≤ry nastΩpnie wyci▒ga siΩ. W zastyg│ym ┐elu znajduje siΩ szereg do│k≤w , do kt≤rych wprowadzane s▒ pr≤bki DNA oraz z regu│y tzw. standard czyli mieszanina cz▒steczek o znanych masach dziΩki czemu mo┐liwa bΩdzie p≤╝niej kalibracja ┐elu. Przed naniesieniem na ┐el pr≤bki musz▒ byµ odpowiednio przygotowane : dodawany jest barwnik , kt≤ry informuje nas p≤╝niej jak daleko zasz│y najszybsze cz▒steczki (co jest niezbΩdne poniewa┐ DNA w ┐elu nie widaµ) oraz zwi▒zek interkaluj▒cy - bromek etydyny , kt≤ry fluoryzuje w ╢wietle UV co pozwoli nam na zlokalizowanie pr▒┐k≤w.

Minimalna ilo╢µ DNA , kt≤r▒ widaµ na ┐elu w postaci pr▒┐ka to 20 ng. Ilo╢µ DNA w pr▒┐ku nie powinna przekraczaµ 200 ng poniewa┐ obserwuje siΩ prze│adowanie kieszonki. »el umieszczony zostaje w specjalnym aparacie do elektroforezy i zalewany buforem przewodz▒cym pr▒d. Pod│▒czony zostaje do zasilacza generuj▒cego pr▒d o sta│ym i okre╢lonym napiΩciu i natΩ┐eniu. Jako╢µ rozdzia│u fragment≤w DNA zmniejsza siΩ w miarΩ zwiΩkszania napiΩcia w czasie elektroforezy. Dla otrzymania optymalnej jako╢ci stosuje siΩ napiΩcie nie wiΩksze ni┐ 5V na 1cm d│ugo╢ci ┐elu.

Kalibracja wielko╢ci fragment≤w cz▒steczek w ┐elu opiera siΩ na zasadzie , ┐e liniowe cz▒steczki DNA migruj▒ w ┐elu agarozowym z prΩdko╢ci▒ odwrotnie proporcjonaln▒ do logarytmu dziesiΩtnego ich masy cz▒steczkowej wyra┐onej w Daltonach lub w tysi▒cach par zasad czyli kb. Kalibracja ┐elu polega na wykre╢leniu krzywej zale┐no╢ci odleg│o╢ci przebytej w czasie elektroforezy przez poszczeg≤lne fragmenty od logarytmu masy cz▒steczkowej.

ElektroforezΩ mo┐na przeprowadzaµ w ┐elach natywnych lub denaturuj▒cych.

Metoda szybka , prosta , powszechnie stosowana. Zdolno╢µ rozdzielcza zale┐y od wielko╢ci por≤w w ┐elu , kt≤rych rozmiary s▒ zdeterminowane przez stΩ┐enie agarozy. »eli bardziej stΩ┐onych tj. 1,4-2,0 % u┐ywa siΩ do rozdzia│u cz▒steczek mniejszych (0,5-2,0 kb). »ele mniej stΩ┐one 0,5-0,7 % stosuje siΩ do rozdzia│u cz▒steczek wiΩkszych (10-20 kb i wiΩcej).

Zalet▒ mo┐e byµ niekiedy fakt , ┐e podczas elektroforezy mo┐liwe jest rozdzielenie cz▒steczek o tej samej wielko╢ci ale zr≤┐nicowanych pod wzglΩdem kszta│tu. Doskona│ym przyk│adem jest rozdzia│ trzech r≤┐nych form plazmidu : CCC (ang. covalently closed circle) , liniowej i OC (ang. open circle). Pierwsza najszybciej wΩdruje w ┐elu , druga nieco wolniej , trzecia najwolniej.

Powstaj▒ przez polimeryzacje monomer≤w akrylamidu w d│ugie │a±cuchy z wytworzeniem wi▒za± poprzecznych przez bisakrylamid. Mo┐na regulowaµ sieciowanie poprzez manipulacjΩ proporcjami stΩ┐e± akrylamidu do bisakrylamidu. Do zaj╢cia reakcji niezbΩdna jest obecno╢µ odpowiedniego katalizatora (PERS - nadsiarczan potasowy) i zwi▒zku inicjuj▒cego reakcjΩ (TEMED). »ele te stosuje siΩ przy rozdziale fragment≤w o wielko╢ci od kilku par zasad (20% poliakrylamid) do tysi▒ca par zasad (3% poliakrylamid) a tak┐e przy rozdziale jednoniciowych cz▒steczek DNA np. do sekwencjonowania.

Poniewa┐ szybko╢µ migracji w ┐elu jednoniciowych cz▒steczek , zale┐y nie tylko od ich wielko╢ci i │adunku ale tak┐e w du┐ym stopniu od ich struktury przestrzennej (w przypadku dwuniciowych cz▒steczek DNA nie ma to wiΩkszego znaczenia) aby dok│adnie okre╢liµ ich wielko╢µ nale┐y weliminowaµ r≤┐nice w szybko╢ci migracji wywo│ane r≤┐n▒ konformacj▒ cz▒steczki. Jest to szczeg≤lnie wa┐ne w przypadku jednoniciowego RNA , kt≤re tworzy miejscowe struktury dwuniciowe. W tym w│a╢nie celu stosuje siΩ ┐ele denaturuj▒ce agarozowe lub poliakrylamidowe. NajczΩ╢ciej u┐ywanymi czynnikami denaturuj▒cymi s▒ : formaldehyd i glioksal w ┐elach agarozowych (przy analizie preparat≤w RNA) lub mocznik w ┐elach poliakrylamidowych (przy analizie jednoniciowych fragment≤w DNA).

Stosowana do rozdzielenia du┐ych cz▒steczek DNA - od 2^.10⁴ do 10⁷ bp czyli od 20 kb do 10 Mb. Mo┐na w ten spos≤b rozdzieliµ ca│e chromosomy np. dro┐d┐owe. Pole elektryczne jest w│▒czane i wy│▒czane w kr≤tkich odstΩpach czasu. Kiedy pole elektryczne jest w│▒czone cz▒steczki migruj▒ zgodnie ze swoj▒ wielko╢ci▒ a gdy zostaje wy│▒czone maj▒ tendencjΩ do relaksacji i zwijania w przypadkowe pΩtle. Czas wymagany do relaksacji jest wprost proporcjonalny do d│ugo╢ci cz▒steczki. NastΩpnie kierunek pola elektrycznego jest zmieniany o 90 lub 180 stopni w stosunku do poprzedniego. D│u┐sze cz▒steczki zaczynaj▒ poruszaµ siΩ wolniej ni┐ kr≤tsze. Powtarzaj▒ce siΩ zmiany kierunku pola stopniowo powoduj▒ rozdzielenie.