TECHNIKA WESTERN BLOT

(bia│ko-przeciwcia│o) - wi▒zanie przeciwcia│a w celu identyfikacji okre╢lonego bia│ka.

1. Przygotowanie ekstrakt≤w kom≤rkowych.

Metody stosowane przy izolacji i oczyszczaniu bia│ek s▒ bardzo r≤┐norodne a ich wyb≤r zale┐y od w│a╢ciwo╢ci danego bia│ka.

2. Rozdzia│ bia│ek w ┐elach poliakrylamidowych. W zale┐no╢ci od zastosowanego uk│adu mo┐na uzyskaµ rozdzia│ polipeptyd≤w stosownie do r≤┐nych w│a╢ciwo╢ci fizykochemicznych. Przyjmuje siΩ , ┐e elektroforeza w obecno╢ci SDS (dodecylosiarczan sodowy) - detergent - frakcjonuje bia│ka zale┐nie od ich masy czyli zarazem d│ugo╢ci │a±cucha polipeptydowego. Eliminuje efekt r≤┐nicowania pod wzglΩdem kszta│tu. SDS powoduje denaturacjΩ bia│ka , dysocjacjΩ podjednostek (rozbija wi▒zania niekowalencyjne) i op│aszczenie. Oko│o1,4 gr SDS wi▒┐e siΩ z 1 gr bia│ka. Ten typ elektroforezy jest najczΩ╢ciej stosowany i mo┐e byµ u┐yty jako metoda analityczna lub stanowiµ element szeregu dalszych bada±. Z│o┐em , w kt≤rym nastΩpuje rozdzia│ jest ┐el poliakrylamidowy. Z regu│y do rozdzia│u bia│ek u┐ywana jest szczeg≤lna wersja elektroforezy tzw. elektroforeza nieci▒g│a , kt≤ra umo┐liwia maksymalne wykorzystanie zdolno╢ci rozdzielczych tej metody. W praktyce oznacza to , ┐e zar≤wno ┐el sk│ada siΩ jakby z dw≤ch warstw (┐el rozdzielaj▒cy i zatΩ┐aj▒cy r≤┐ni▒ce siΩ sk│adem procentowym) jak r≤wnie┐ bufor do elektroforezy inny jest w g≤rnym inny w dolnym zbiorniku aparatu do elektroforezy. Pr≤bki nak│adane na ┐el mog▒ mieµ stosunkowo du┐▒ objΩto╢µ poniewa┐ w czasie przechodzenia przez g≤rn▒ warstwΩ ┐elu zostaj▒ zagΩszczone do w▒skiego pasma aby w dolnym ┐elu ulec rozdzieleniu na pojedyncze , ostre pr▒┐ki. DziΩki temu , ┐e frakcjonowanie zachodzi w zale┐no╢ci od d│ugo╢ci │a±cucha polipeptydowego jeste╢my w stanie ustaliµ masΩ cz▒steczkow▒ danego bia│ka przez por≤wnywanie z odpowiednimi standardami o znanych masach , z dok│adno╢ci▒ do 5-10%.

3. Renaturacja.

Inkubacja z odpowiednim buforem.

4. Transfer bia│ek z ┐elu na membranΩ nitrocelulozow▒.

Z regu│y elektrotransfer.

5. Immunoblotting.

Jednym z niebezpiecze±stw jest to , ┐e bia│ka zaadsorbowane do nitrocelulozy mog▒ mieµ nieco zmieniony uk│ad przestrzenny aminokwas≤w a poniewa┐ rozdzielane s▒ w ┐elu w formie zdenaturowanej a nastΩpnie musz▒ ulec renaturacji , mog▒ w og≤le nie przyjmowaµ swojej natywnej postaci.
a. Zablokowanie miejsc niespecyficznych.
b. Inkubacja ze specyficznymi dla poszukiwanego bia│ka przeciwcia│ami.
c. Inkubacja z odczynnikiem u┐ywanym do detekcji.

NajczΩ╢ciej s▒ to II (drugorzΩdowe) przeciwcia│a czyli przeciwcia│a , dla kt≤rych antygenem jest przeciwcia│o specyficzne. II przeciwcia│a zwi▒zane s▒ z barwnikami fluorescencyjnymi , cz▒stkami z│ota lub enzymami. Systemy detekcyjne musz▒ byµ proste i czu│e. Mo┐na wykryµ za ich pomoc▒ nawet 10^-9 do 10^-12 gr bia│ka. II przeciwcia│a mog▒ byµ skoniugowane z enzymem , kt≤ry zmienia kolor substratu podczas reakcji np. z AP - alkaliczn▒ fosfataz▒ (w zale┐no╢ci od u┐ytego substratu utworzony zwi▒zek jest ciemno niebieski lub purpurowy) lub z HRP - peroksydaz▒ szczurz▒ (utlenienie odpowiednich substrat≤w prowadzi do powstawania ciemnego str▒tu w miejscu reakcji). Innym systemem detekcji jest awidyna lub streptawidyna skoniugowana z enzymem (AP lub HRP). Awidyna i streptawidyna silnie wi▒┐▒ siΩ z biotyn▒. I przeciwcia│a znakuje siΩ biotyn▒ a zamiast II przeciwcia│ do detekcji u┐ywa siΩ awidyny lub streptawidyny skoniugowanej z enzymem. Poniewa┐ jedna cz▒steczka awidyny lub streptawidyny zwi▒zana jest z kilkoma cz▒steczkami enzymu system detekcji jest bardziej czu│y ni┐ w przypadku u┐ycia przeciwcia│.

NastΩpny system to tzw. system NIP. Stworzony aby ograniczyµ ilo╢µ niespecyficznych reakcji II przeciwcia│. I przeciwcia│a znakuje siΩ nitrojodofenolem (NIP) , II przeciwcia│a skoniugowane z enzymem s▒ skierowane przeciwko NIP. Poniewa┐ NIP jest zwi▒zkiem drobnocz▒steczkowym reakcja przeciwcia│ jest bardzo specyficzna. Kolejny rodzaj to systemy nieenzymatyczne. Na przyk│ad II przeciwcia│a wyznakowane koloidalnym z│otem lub radioaktywnie (¹²⁵I). W pierwszym przypadku uzyskuje siΩ bezpo╢rednie uwidocznienie reakcji , w drugim detekcja wymaga autoradiografii.

TECHNIKA NORTHERN

ZNAKOWANIE W CELU WIZUALIZACJI WYNIKU

Webmaster