![]() |
SCREENING BANKU GEN╙W CZYLI IDENTYFIKACJA ODPOWIEDNIEGO KLONU. SZUKANIE IGúY W STOGU SIANA ? Gdy zale┐y nam na wyodrΩbnieniu pojedynczego , konkretnego genu jakiego╢ organizmu to po utworzeniu banku gen≤w tego organizmu i stransformowaniu nim odpowiednich kom≤rek gospodarza nale┐y zidentyfkowaµ klon kom≤rek , w kt≤rym znajduje siΩ gen. Przeszukiwanie jest zazwyczaj bardzo pracoch│onne. Testowanie polega na wysiewaniu na szalki kom≤rek gospodarza np. bakterii z plazmidami bad╝ fagami w takim stΩ┐eniu aby mo┐liwe by│o odr≤┐nienie poszczeg≤lnych kolonii lub │ysinek. Liczba tych szalek jest w najlepszym przypadku rzΩdu kilkaset a dochodzi nawet do kilku tysiΩcy. Wyb≤r metody screeningu jest uzale┐niony od szeregu czynnik≤w 1. METODY HYBRYDYZACYJNE - stosuje siΩ w przypadku dysponowania sond▒ molekularn▒ DNow▒ lub RNow▒ homologiczn▒ do poszukiwanej sekwencji w r≤┐nym stopniu - niekoniecznie w 100%. Nie jest w tym przypadku wymagana ekspresja sklonowanego genu w kom≤rkach gospodarza. Hybrydyzacja - powstawanie stabilnych struktur dwuniciowych z cz▒steczek o komplementarnych sekwencjach nukleotyd≤w. Pojawiaj▒ siΩ one ju┐ nawet wtedy gdy istniej▒ kilkunastonukleotydowe odcinki o komplementarnym uk│adzie zasad. Kompleks taki charakteryzuje siΩ specyficzn▒ ôtemperatur▒ przej╢ciaö powy┐ej kt≤rej ulega dysocjacji. Specyficzno╢µ hybrydyzacji zale┐y od sekwencji i sk│adu nukleotyd≤w , si│y jonowej stosowanych bufor≤w oraz temperatury. Operuj▒c tymi parametrami mo┐emy uzyskiwaµ hybrydyzacjΩ cz▒steczek , kt≤rych homologia nie przekracza 50%. Sond▒ molekularn▒ mo┐e byµ odcinek DNA lub RNA homologiczny do fragmentu , kt≤ry chcemy odnale╝µ. Niekoniecznie w pe│ni komplementarny do poszukiwanej sekwencji. Wtedy tak┐e zachodzi hybrydyzacja jednak z mniejsz▒ wydajno╢ci▒ a utworzony kompleks jest mniej trwa│y. Sonda musi byµ wyznakowana (radioaktywnie lub nieradioaktywnie) czyli zwi▒zana ze znacznikiem , kt≤ry umo┐liwi jej uwidocznienie a zarazem zlokalizowanie zhybrydyzowanej z ni▒ sekwencji. Sondy :
Sondy znakowaµ mo┐na :
Metody hybrydyzacyjne to :
![]() 2. METODY IMMUNOLOGICZNE - mog▒ byµ stosowane do detekcji ka┐dego bia│ka je╢li tylko mo┐emy uzyskaµ przeciwcia│a. Nale┐y jednak pamiΩtaµ , ┐e przeciwcia│a wi▒┐▒ siΩ jedynie z niewielkimi fragmentami bia│ka - epitopami , kt≤re maj▒ charakter przestrzenny. Wymagana jest zatem w│a╢ciwa konformacja bia│ka przy reakcji. Warunkiem u┐ycia tego typu metod jest ekspresja poszukiwanych gen≤w w kom≤rkach gospodarza banku. Szczeg≤lnie skuteczne w przypadku bibliotek cDNA. Umo┐liwia znalezienie genu w przypadku gdy dysponujemy oczyszczonym bia│kiem a szukamy genu je koduj▒cego. Metody immunologiczne to :
3. METODY SELEKCJI BEZPOªREDNIEJ - stosowane w przypadku gdy znany jest bezpo╢redni efekt fenotypowy klonowanego genu - gdy jego ekspresja powoduje zmiany morfologiczne lub fizjologiczne transformowanych kom≤rek. Za│o┐eniem tego typu screeningu jest ekspresja klonowanych gen≤w w kom≤rkach gospodarza. Przyk│ady : - Poszukujemy genu koduj▒cego b galaktozydazΩ , po transformacji kom≤rek E.coli bankiem gen≤w i wysianiu ich na pod│o┐e z X-gal - zwi▒zek , kt≤ry spowoduje niebieskie zabarwienie kolonii wytwarzaj▒cych ten enzym. Poniewa┐ do transformacji u┐ywamy kom≤rek nie wytwarzaj▒cych tego enzymu to jedynie te klony kom≤rek , do kt≤rych trafi│ wektor z poszukiwanym genem stan▒ siΩ niebieskie. - Komplementacja mutacji : poszukujemy gen koduj▒cy jeden z enzym≤w na szlaku biosytnezy argininy u dro┐d┐y , transformujemy szczep dro┐d┐y arg_ i wysiewamy na po┐ywkΩ bez argininy. W tym przypadku wyrosn▒ tylko te kom≤rki , w kt≤rych bΩdzie eksprymowany gen koduj▒cy odpowiedni enzym z tego szlaku. - Poszukujemy genu koduj▒cego hemolizynΩ , bank gen≤w wysiewamy na pod│o┐e z krwi▒. Klon zawieraj▒cy poszukiwany gen ujawni fenotypowy efekt hemolizy erytrocyt≤w wok≤│ kolonii.
REKOMBINOWANE DNA W MEDYCYNIE , PRZEMYªLE I FARMACJI. WSPANIAúA WIZJA PRZYSZúOªCI ?
![]() ⌐ 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie Webmaster ![]() |