SCREENING BANKU GEN╙W CZYLI IDENTYFIKACJA ODPOWIEDNIEGO KLONU. SZUKANIE IGúY W STOGU SIANA ?

Gdy zale┐y nam na wyodrΩbnieniu pojedynczego , konkretnego genu jakiego╢ organizmu to po utworzeniu banku gen≤w tego organizmu i stransformowaniu nim odpowiednich kom≤rek gospodarza nale┐y zidentyfkowaµ klon kom≤rek , w kt≤rym znajduje siΩ gen. Przeszukiwanie jest zazwyczaj bardzo pracoch│onne. Testowanie polega na wysiewaniu na szalki kom≤rek gospodarza np. bakterii z plazmidami bad╝ fagami w takim stΩ┐eniu aby mo┐liwe by│o odr≤┐nienie poszczeg≤lnych kolonii lub │ysinek. Liczba tych szalek jest w najlepszym przypadku rzΩdu kilkaset a dochodzi nawet do kilku tysiΩcy. Wyb≤r metody screeningu jest uzale┐niony od szeregu czynnik≤w

1. METODY HYBRYDYZACYJNE - stosuje siΩ w przypadku dysponowania sond▒ molekularn▒ DNow▒ lub RNow▒ homologiczn▒ do poszukiwanej sekwencji w r≤┐nym stopniu - niekoniecznie w 100%. Nie jest w tym przypadku wymagana ekspresja sklonowanego genu w kom≤rkach gospodarza.

Hybrydyzacja - powstawanie stabilnych struktur dwuniciowych z cz▒steczek o komplementarnych sekwencjach nukleotyd≤w. Pojawiaj▒ siΩ one ju┐ nawet wtedy gdy istniej▒ kilkunastonukleotydowe odcinki o komplementarnym uk│adzie zasad. Kompleks taki charakteryzuje siΩ specyficzn▒ ôtemperatur▒ przej╢ciaö powy┐ej kt≤rej ulega dysocjacji. Specyficzno╢µ hybrydyzacji zale┐y od sekwencji i sk│adu nukleotyd≤w , si│y jonowej stosowanych bufor≤w oraz temperatury. Operuj▒c tymi parametrami mo┐emy uzyskiwaµ hybrydyzacjΩ cz▒steczek , kt≤rych homologia nie przekracza 50%.

Sond▒ molekularn▒ mo┐e byµ odcinek DNA lub RNA homologiczny do fragmentu , kt≤ry chcemy odnale╝µ. Niekoniecznie w pe│ni komplementarny do poszukiwanej sekwencji. Wtedy tak┐e zachodzi hybrydyzacja jednak z mniejsz▒ wydajno╢ci▒ a utworzony kompleks jest mniej trwa│y. Sonda musi byµ wyznakowana (radioaktywnie lub nieradioaktywnie) czyli zwi▒zana ze znacznikiem , kt≤ry umo┐liwi jej uwidocznienie a zarazem zlokalizowanie zhybrydyzowanej z ni▒ sekwencji.

Sondy :

• Fragment DNA , cDNA lub RNA poszukiwanego przez nas genu sklonowanego wcze╢niej z innego gatunku do╢µ blisko spokrewnionego. W tym celu wybieramy region ewolucyjnie konserwowany w DNA danego genu czyli taki , w kt≤rym w czasie ewolucji nie nagromadzi│o siΩ zbyt du┐o znacz▒cych zmian nawet u r≤┐nych , czasami nawet do╢µ odleg│ych ewolucyjnie gatunk≤w. Warunki hybrydyzacji musz▒ byµ odpowiednio dobrane. CzΩ╢µ poszukiwanego przez nas genu.
• Syntetyczny oligonukleotyd o sekwencji komplementarnej do odcinka DNA koduj▒cego fragment bia│ka je╢li znana jest sekwencja aminokwasowa tego bia│ka. W praktyce oznacza to zsyntetyzowanie ca│ej rodziny takich oligonukleotyd≤w z powodu zdegenerowania kodu genetycznego , z kt≤rych tylko czΩ╢µ bΩdzie idealnie komplementarna do poszukiwanej sekwencji.
• Sonda utworzona dziΩki amplifikacji metod▒ PCR np. bardzo rzadkiego fragmentu DNA.

Sondy znakowaµ mo┐na :

• radioaktywnie - do sondy w│▒czany jest nukleotyd znakowany radioaktywnym izotopem. Detekcja opiera siΩ na autoradiografii przy zastosowaniu film≤w wra┐liwych na promieniowanie.
• nieradioaktwnie np. metodami fluorescencyjnymi - emisja ╢wiat│a o okre╢lonej d│ugo╢ci fali , wykorzystywane s▒ zwi▒zki tj. Rodamina , kumaryna czy fluoresceina. Detekcja odbywa siΩ przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego.
• immunochemicznie , cytochemicznie - do sondy w│▒czany jest nukleotyd sprzΩ┐ony z haptenem (biotyn▒ , digoksygenin▒ , fluorescein▒). Detekcja odbywa siΩ przy pomocy przeciwcia│ specyficznych dla danego haptenu. Przeciwcia│a s▒ sprzΩ┐one z umo┐liwiaj▒cymi ich uwidocznienie cz▒steczkami : alkaliczn▒ fosfataz▒ , peroksydaz▒ , barwnikami fluorescencyjnymi czy koloidalnym z│otem.
• enzymatycznie - do sondy w│▒czany jest nukleotyd sprzΩ┐ony z cz▒steczk▒ enzymu. Detekcja opiera siΩ na reakcji barwnej katalizowanej przez enzym markerowy.

Metody hybrydyzacyjne to :

• HYBRYDYZACJA TYPU SOUTHERN (DNA-DNA)
• HYBRYDYZACJA TYPU NORTHERN (RNA-DNA)
• HYBRYDYZACJA KOLONIJNA
  Hybrydyzacja kolonijna - po transformacji kom≤rek bakteryjnych bankiem plazmidowym. Po wysianiu na szalki Petriego replikuje siΩ kolonie na filtr. Wykonuje siΩ szereg czynno╢ci , kt≤re maj▒ na celu przytwierdzenie bakterii , ich lizΩ i denaturacjΩ in situ a nastΩpnie poddaje siΩ hybrydyzacji i autoradiografii. DziΩki zachowaniu szalki wzorcowej jeste╢my w stanie okre╢liµ dok│adnie koloniΩ , w kt≤rej znajduje siΩ hybrydyzuj▒cy fragment.
• HYBRYDYZACJA úYSINKOWA
  Hybrydyzacja │ysinkowa - po transformacji kom≤rek bakteryjnych bankiem fagowym i wysianiu ich na szalki Petriego replikuje siΩ kolonie na filtr. Przytwierdza siΩ przeniesione fagi do filtru i hybrydyzuje z sond▒ i poddaje autoradiografii. Tak┐e w tym przypadku dziΩki szalce wzorcowej jeste╢my w stanie zidentyfikowaµ │ysinki , kt≤rych pozycje odpowiadaj▒ zaczernieniom na kliszy.

2. METODY IMMUNOLOGICZNE - mog▒ byµ stosowane do detekcji ka┐dego bia│ka je╢li tylko mo┐emy uzyskaµ przeciwcia│a. Nale┐y jednak pamiΩtaµ , ┐e przeciwcia│a wi▒┐▒ siΩ jedynie z niewielkimi fragmentami bia│ka - epitopami , kt≤re maj▒ charakter przestrzenny. Wymagana jest zatem w│a╢ciwa konformacja bia│ka przy reakcji. Warunkiem u┐ycia tego typu metod jest ekspresja poszukiwanych gen≤w w kom≤rkach gospodarza banku. Szczeg≤lnie skuteczne w przypadku bibliotek cDNA. Umo┐liwia znalezienie genu w przypadku gdy dysponujemy oczyszczonym bia│kiem a szukamy genu je koduj▒cego.

Metody immunologiczne to :

• TECHNIKA WESTERN (bia│ko-przeciwcia│o)

3. METODY SELEKCJI BEZPOªREDNIEJ - stosowane w przypadku gdy znany jest bezpo╢redni efekt fenotypowy klonowanego genu - gdy jego ekspresja powoduje zmiany morfologiczne lub fizjologiczne transformowanych kom≤rek. Za│o┐eniem tego typu screeningu jest ekspresja klonowanych gen≤w w kom≤rkach gospodarza.

Przyk│ady :

- Poszukujemy genu koduj▒cego b galaktozydazΩ , po transformacji kom≤rek E.coli bankiem gen≤w i wysianiu ich na pod│o┐e z X-gal - zwi▒zek , kt≤ry spowoduje niebieskie zabarwienie kolonii wytwarzaj▒cych ten enzym. Poniewa┐ do transformacji u┐ywamy kom≤rek nie wytwarzaj▒cych tego enzymu to jedynie te klony kom≤rek , do kt≤rych trafi│ wektor z poszukiwanym genem stan▒ siΩ niebieskie.

- Komplementacja mutacji : poszukujemy gen koduj▒cy jeden z enzym≤w na szlaku biosytnezy argininy u dro┐d┐y , transformujemy szczep dro┐d┐y arg^_ i wysiewamy na po┐ywkΩ bez argininy. W tym przypadku wyrosn▒ tylko te kom≤rki , w kt≤rych bΩdzie eksprymowany gen koduj▒cy odpowiedni enzym z tego szlaku.

- Poszukujemy genu koduj▒cego hemolizynΩ , bank gen≤w wysiewamy na pod│o┐e z krwi▒. Klon zawieraj▒cy poszukiwany gen ujawni fenotypowy efekt hemolizy erytrocyt≤w wok≤│ kolonii.

WEKTOR PO úACINIE ZNACZY PRZEWO¼NIK.

REKOMBINOWANE DNA W MEDYCYNIE , PRZEMYªLE I FARMACJI. WSPANIAúA WIZJA PRZYSZúOªCI ?

Webmaster