WEKTOR - cz▒steczka DNA mog▒ca byµ no╢nikiem interesuj▒cego nas kawa│ka DNA , kt≤ra posiada zdolno╢µ do autonomicznej replikacji w danym typie kom≤rek. Zapewnia powielanie wprowadzonego fragmentu DNA czyli klonowanie a czasami tak┐e wydajn▒ synt ezΩ kodowanego przez gen bia│ka (transkrypcjΩ i translacjΩ oraz jego stabilno╢µ) jak to ma miejsce w tzw. wektorach ekspresyjnych. S▒ r≤┐ne typy wektor≤w a dobranie odpowiedniego zale┐y m.in. od tego w jakich kom≤rkach zamierzamy klonowaµ gen. Najwa┐niejszym elementem warunkuj▒cym specyficzno╢µ wektora s▒ sekwencje odpowiedzialne za inicjacjΩ replikacji tzw. sekwencje ori. Najprostsze wektory posiada│y wy│▒cznie jedno , unikalne miejsce restrykcyjne , w kt≤re mo┐na by│o wprowa dziµ obcy DNA. Obecnie najczΩ╢ciej jest to tzw. polilinker - syntetyczny odcinek DNA , w kt≤rym znajduje siΩ zwykle kilkana╢cie miejsc rozpoznawanych przez r≤┐ne restryktazy.
Pozwala to na swobodniejszy dob≤r odpowiedniego do klonowania enzymu. Wektory zazwyczaj posiadaj▒ r≤wnie┐ geny markerowe czyli geny koduj▒ce bia│ka odpowiedzialne za │atwo wyr≤┐nialne cechy fenotypowe. Wektor mus i byµ tak skonstruowany aby istnia│a mo┐liwo╢µ selekcji tych kom≤rek , do kt≤rych wnikn▒│. Jego budowa powinna pozwalaµ tak┐e na odr≤┐nienie wektora zrekombinowanego od takiego , kt≤ry zamkn▒│ siΩ bez ligacji z fragmentem DNA.

Budowa - niedu┐e , koliste cz▒steczki DNA zawieraj▒ce ori replikacji , gen markera selekcyjnego (najczΩ╢ciej oporno╢µ na antybiotyk) oraz miejsce do klonowania.

Wektory plazmidowe wprowadzane s▒ do kom≤rek bakterii przy wykorzystaniu zjawiska transformacji. W przypadku stosowanej najczΩ╢ciej bakterii - E.coli wymaga to zwiΩkszenia przepuszczalno╢ci b│on kom≤rkowych czyli ukompetentnienia. W tym c elu wystawia siΩ kom≤rki na wysok▒ koncentracjΩ pewnych dwuwarto╢ciowych kation≤w. W typowej procedurze kom≤rki traktuje siΩ roztworem chlorku wapnia. Zazwyczaj 1 kom≤rka na milion zostaje stransformowana. 1 cz▒steczka na tysi▒c zrekombinowanych plazmid≤w transformuje kom≤rkΩ bakteryjn▒. Ka┐da kompetentna kom≤rka inkorporuje tylko jeden plazmid. SelekcjΩ zazwyczaj uzyskuje siΩ na dwa sposoby. Pierwszy z nich to obecno╢µ w plazmidzie dw≤ch gen≤w oporno╢ci na dwa r≤┐ne antybiotyki przy czym w j ednym z nich znajduje siΩ miejsce do klonowania. Kom≤rka , kt≤ra nie pobra│a plazmidu bΩdzie wra┐liwa na obydwa antybiotyki , taka , kt≤ra pobra│a plazmid niezrekombinowany bΩdzie oporna na obydwa. Kom≤rka , kt≤ra ma plazmid z fragmentem obcego DNA bΩdzie wra┐liwa na antybiotyk , w kt≤rego genie by│o miejsce restrykcyjne , poniewa┐ ci▒g│o╢µ genu zostanie przerwana co unieczynni produkowane bia│ko. Drugi spos≤b to system selekcji opieraj▒cy siΩ na tzw. te╢cie alfa-komplementacji. Polilinkery wiΩkszo╢ci wek tor≤w umiejscowione s▒ w obrΩbie genu koduj▒cego a peptyd b-galaktozydazy. Transformowane s▒ bakterie , kt≤re maj▒ mutacjΩ akurat we fragmencie genu koduj▒cym t▒ czΩ╢µ enzymu. Umo┐liwia to selekcjΩ na odpowiedniej po┐ywce bakterii , kt≤re pobra│y zrekombi nowany plazmid poniewa┐ tylko one bΩd▒ bia│e w odr≤┐nieniu od tych , w kt≤rych zasz│a komplementacja mutacji i sprawny enzym rozk│ada substrat dodany w po┐ywce co powoduje niebieskie zabarwienie kolonii.

Pojedyncze kom≤rki bakteryjne , utworz▒ kolonie a wszystkie plazmidy w takiej kolonii bΩd▒ pochodzi│y od jednego plazmidu wprowadzonego do kom≤rki , kt≤ra t▒ koloniΩ za│o┐y│a. Powstanie wiΩc klon a fragment DNA na plazmidzie to sklonowany DNA.

Pojemno╢µ wektor≤w plazmidowych ograniczona jest sposobem wprowadzania rekombinacyjnych cz▒stek DNA do kom≤rek gospodarza. Przy klasycznej transformacji wielko╢µ wstawki nie powinna byµ wiΩksza ni┐ oko│o 10 kb.

Warto zwr≤ciµ jeszcze uwagΩ na ilo╢µ kopii wektora w kom≤rce. Istniej▒ wektory niskokopijne i wysokokopijne co uzale┐nione jest od rodzaju ori.

Klonowanie w wektorze plazmidowym polega na przeciΩciu go stosownym enzymem restrykcyjnym , defosforylacji jego ko±c≤w w celu wyeliminowania mo┐liwo╢ci recyrkularyzacji samego wektora oraz ligacji , kt≤r▒ to reakcjΩ przeprowadza ligaza DNA tworz ▒ca standardowe wi▒zanie fosfodiestrowe , z odpowiednio wcze╢niej przygotowanymi fragmentami DNA , kt≤re chcemy sklonowaµ , pociΩtymi t▒ sam▒ restryktaz▒ lub daj▒c▒ komplementarne ko±ce.

LAMBDOWE - pochodne faga l.

Mo┐na w nich klonowaµ wiΩksze fragmenty DNA. Inn▒ zalet▒ jest wy┐sza wydajno╢µ infekcji cz▒stkami bakteriofag≤w w por≤wnaniu do wydajno╢ci transformacji.Budowa : odpowiednio zmodyfikowany bakt eriofag l. Wprowadzono mutacje punktowe w niekt≤rych genach zmieniaj▒ce w│a╢ciwo╢ci ich produkt≤w : kr≤tkie delecje oraz niekiedy usuniΩcie ╢rodkowego regionu DNA odpowiedzialnego za cykl lizogenny. Z DNA faga mo┐na usun▒µ oko│o 30% genomu pozostawiaj▒c j ego lewe i prawe ramiΩ zawieraj▒ce wszystkie geny niezbΩdne w cyklu litycznym. DziΩki 12 nukleotydowym , wzajemnie komplementarnym , jednoniciowym fragmentom DNA na ko±cach cz▒steczki DNA faga - tzw. sekwencjom cos - mo┐liwe jest przybranie przez D NA faga w kom≤rce bakteryjnej formy kolistej oraz zapakowanie go w bia│kow▒ g│≤wkΩ. R≤wnie┐ w te wektory wstawione s▒ polilinkery , geny markerowe , silne promotory i inne.

S▒ dwa rodzaje wektor≤w lambdowych , co spowodowane jest faktem , ┐e do bia│kowej g│≤wki pakowane jest DNA d│ugo╢ci 75% do 105% d│ugo╢ci DNA faga typu dzikiego :

• replacement - tak skonstruowane , ┐e centralny region jest oflankowany identycznym zestawem miejsc restrykcyjnych tak , ┐e przeciΩcie dan▒ restryktaz▒ wycina ten region z wektora. Na jego miejsce mo┐e byµ wstawiony obcy DNA d│ugo╢ci 9-25 kb. Klonow anie polega na izolacji poszczeg≤lnych ramion po wyciΩciu regionu centralnego i ligacji ze zdefosforylowanymi fragmentami obcego DNA (co uniemo┐liwia wstawienie dw≤ch r≤┐nych odcink≤w DNA do jednego wektora) w warunkach sprzyjaj▒cych tworzeniu konkata mer≤w , nastΩpnie pakowaniu in vitro w kapsydy faga i infekcji kom≤rek E.coli.

• insercyjne - zawieraj▒ce drobne modyfikacje dzikiego genomu faga. Odcinek obcego DNA musi zawieraµ siΩ w granicach od 0 do 8 kb. Klonowanie polega na przeciΩciu odpowiednim enzymem restrykcyjnym w miejscu do klonowania , izolacji poszczeg≤lnych ramion i ligacji z fragmentami DNA w warunkach umo┐liwiaj▒cych tworzenie konkatamer≤w , pakowaniu w kapsydy faga i infekcji E.coli.

Wprowadzanie do kom≤rek gospodarza odbywa siΩ z wysok▒ efektywno╢ci▒ - z regu│y 1 na 20 cz▒steczek zrekombinowanego wektora jest efektywnie pakowana w kapsyd i wprowadzana do kom≤rek E.coli na drodze transfekcji.

POCHODNE FAGA M13 - szczeg≤lny cykl ┐yciowy tego faga pozwala na wykorzystanie go do wytwarzania jednoniciowego DNA czyli kiedy chodzi np. o sekwencjonowanie DNA lub ukierunkowan▒ mutagenezΩ.

KOSMIDOWE - stosowane do klonowania du┐ych fragment≤w DNA np. operon≤w prokariotycznych czy gen≤w eukariotycznych. Budowa : s▒ to zmodyfikowane plazmidy zawieraj▒ce sekwencjΩ cos faga l konieczn▒ przy pakowaniu DNA do kapsyd≤w fago wych. Najprostsze kosmidy zawieraj▒ ori repilkacji , gen markera selekcyjnego , miejsce do klonowania oraz sekwencjΩ cos. Modyfikacje tego typu wektor≤w polegaj▒ na zwiΩkszaniu ilo╢ci miejsc do klonowania (polilinkery) , wprowadzaniu element ≤w umo┐liwiaj▒cych analizΩ klonowanego DNA np. promotor≤w fag≤w T3 , T7 itp. , wprowadzeniu element≤w umo┐liwiaj▒cych propagacjΩ wektora w kom≤rkach eukariotycznych tj. ori eukariotyczne , gen markera selekcyjnego dla kom≤rek eukariotycznych oraz w prowadzeniu drugiej sekwencji cos.

Wprowadzanie rekombinowanych cz▒steczek wektora jest podobne do infekcji fagowej. DNA wektora zligowanego z odpowiedniej wielko╢ci fragmentami obcego DNA jest in vitro pakowany w kapsydy faga a nastΩpnie wprowadzany do kom≤rek gospodarza na drodze transdukcji. Tam kosmidy zachowuj▒ siΩ jak plazmidy. Pojemno╢µ takiego wektora jest ograniczona obustronnie. Klonowany DNA musi byµ wielko╢ci od 35 do 45 kb poniewa┐ do kapsydu mo┐e zostaµ wprowadzo ny DNA nie mniejszy ni┐ 38 kb i nie wiΩkszy ni┐ 52 kb. Tak wiΩc proces pakowania wymaga powstania uk│adu dw≤ch sekwencji cos na jednej cz▒steczce DNA oddalonych od siebie o 38 do 52 kb. Osi▒ga siΩ to albo tn▒c wektor odpowiedni▒ restryktaz▒ i defos forylowany liguj▒c z odpowiedniej wielko╢ci fragmentami obcego DNA przy wysokim stΩ┐eniu DNA i nadmiarze wektora (9:1) co sprzyja powstawaniu konkatamer≤w albo gdy wektor zawiera dwie sekwencje cos , rozcina siΩ go w dw≤ch miejscach : w miejscu do klonowania i miΩdzy sekwencjami cos , nastΩpnie liguje siΩ go ze zdefosforylowanymi fragmentami obcego DNA przy wysokim stΩ┐eniu ATP co powoduje , ┐e │▒czenie tΩpych ko±c≤w jest bardzo ma│o wydajne a wiΩc g│≤wnym produktem reakcji jest obcy DNA po│ ▒czony z fragmentami wektora.

WEKTORY DRO»D»OWE. Dro┐d┐e jako kom≤rki gospodarzy posiadaj▒ niezaprzeczalne zalety : maj▒ struktury kom≤rkowe typowe dla eukariota , geny w nich klonowane mog▒ zawieraµ sekwencje intronowe , proces obr≤bki mRNA jest zbli┐ony do tego , kt≤ry wys tΩpuje u wy┐szych eukariont≤w , bia│ka podlegaj▒ modyfikacjom posttranslacyjnym. Wynika z tego , ┐e klonowaµ DNA w dro┐d┐ach nale┐y wtedy gdy zale┐y nam na uzyskaniu ekspresji badanego genu w kom≤rce eukariotycznej i odpowiednio zmodyfikowanych bia│kowych produkt≤w. WystΩpuj▒ dwa typy tych wektor≤w : replikatywne - gdy ori pochodzi z chromosom≤w dro┐d┐y (tzw. sekwencja ars) lub episomalne - gdy ori pochodzi z naturalnie wystΩpuj▒cego u dro┐d┐y plazmidu 2 m.

Poza tym wektory te posiadaj▒ geny markerowe oraz polilinkery.

Mog▒ to byµ wektory bifunkcjonalne (wahad│owe) czyli maj▒ce odrΩbne miejsca startu replikacji i geny markerowe dla kom≤rek dro┐d┐owych jak i bakteryjnych np. E.coli co umo┐liwia m.in. klonowanie gen≤w w kom≤rkach bakteryjnych a badanie ich ekspr esji w dro┐d┐ach.

Skonstruowano r≤wnie┐ sztuczne chromosomy dro┐d┐owe czyli YAC. Istnieje mo┐liwo╢µ klonowania w nich bardzo du┐ych fragment≤w DNA do 500 kb. YAC posiada sekwencje , kt≤re umo┐liwiaj▒ replikacjΩ naturalnych chromosom≤w czyli ars oraz zapewniaj▒ se gregacjΩ podczas podzia│u - sekwencje telomerowe i centromerowe , ponadto znajduj▒ siΩ tam geny markerowe i polilinkery.

INNE WEKTORY.

WEKTORY POCHODNE WIRUSA SV40 (Simian Virus) - zbudowane z 500 bp fragmentu DNA wirusa zawieraj▒cego ori , promotory gen≤w koduj▒cych wczesne bia│ka wirusa a tak┐e sekwencje regulacyjne odpowiedzialne za aktywacjΩ transkrypcji z tych prom otor≤w przez kom≤rkowe czynniki transkrypcyjne. U┐ywany do klonowania w kom≤rkach ssaczych.

WEKTORY POCHODNE RETROWIRUS╙W - stosuje siΩ je w tzw. bezpiecznych uk│adach z│o┐onych. Pierwszy sk│adnik to dwuniciowe DNA z sekwencjami LTR (long terminal repeats - d│ugie ko±cowe powt≤rzenia) , pe│ni▒cymi funkcjΩ promotor≤w gen≤w wirusa i niezbΩd ne do integracji DNA wirusa z chromosomem gospodarza oraz z sekwencji psi warunkuj▒cej pakowanie kwasu nukleinowego do kapsydu. Drugi sk│adnik to linia kom≤rek z prowirusem pozbawionym sekwencji psi a posiadaj▒cym geny koduj▒ce bia│ka otoczk i wirusa i odwrotn▒ transkryptazΩ. Klonowanie w kom≤rkach ssaczych przeprowadza siΩ w ten spos≤b , ┐e DNA retrowirusa z w│▒czonym do niego obcym genem wprowadza siΩ do specjalnej linii kom≤rkowej , w kt≤rej produkt jego transkrypcji pakowany jest w otoczk i bia│kowe , izoluje siΩ je i infekuje nimi kom≤rki docelowe. Tu nastΩpuje przepisanie z RNA na DNA , kt≤ry w│▒czany jest do chromosomu co daje pocz▒tek transformowanej linii kom≤rkowej.

WEKTORY POCHODNE BAKULOWIRUS╙W - wektor skonstruowany zosta│ z sekwencji bakteryjnych ori i genu oporno╢ci na antybiotyk a tak┐e kasety ekspresyjnej , w sk│ad kt≤rej w chodzi polilinker i sekwencje regulacyjne genu polihedryny bakulowirus a czyli promotor i terminator. Kom≤rki owad≤w lub ca│e larwy transfekuje siΩ mieszanin▒ DNA bakulowirusa i zlinearyzowanego wektora nios▒cego zrekombinowany gen i gen markerowy umo┐liwiaj▒cy selekcjΩ w kom≤rkach owad≤w. Wewn▒trz kom≤rki dochodzi do homolo gicznej rekombinacji i utworzenia zrekombinowanego wirusa , kt≤ry zamiast genu polihedryny ma gen , kt≤ry chcemy sklonowaµ. Dochodzi tu do prawid│owych modyfikacji posttranslacyjnych klonowanych bia│ek. Wydajno╢µ produkcji jest do╢µ niska a koszt stosunko wo wysoki. Znajduj▒ one zastosowanie przy produkcji odczynnik≤w analitycznych , diagnostycznych i niekt≤rych lek≤w.

WEKTORY POCHODNE ADENOWIRUS╙W - w cyklu rozwojowym wprowadzaj▒ wiele kopii DNA do kom≤rki. Informacja genetyczna ulega ekspresji ale nie ulega replikacji poniewa┐ znajduje siΩ poza DNA gospodarza. W kolejnych pokoleniach kom≤rek wprowadzonego DN A jest coraz mniej. Wprowadzane odcinki DNA nie mog▒ byµ zbyt d│ugie. Stosowany do klonowania w kom≤rkach ssaczych.

Zawieraj▒ odpowiednio usytuowany silny promotor umo┐liwiaj▒cy ekspresjΩ na wysokim poziomie bia│ka , kt≤rego gen znajduje siΩ na tym wektorze.

1. Plazmidowe wektory ekspresyjne zawieraj▒ce silne , regulowane promotory. Taki silny , regulowany promotor powoduje , ┐e w specyficznych warunkach transkrypcja jest inicjowana wiele razy na minutΩ. Przyk│adem mo┐e byµ promotor laktozowy. TranskrypcjΩ wzmaga siΩ przez dodanie do po┐ywki IPTG (analog laktozy).

2. Plazmidowe wektory ekspresyjne zawieraj▒ce promotor p≤╝nych bia│ek faga T7. Promotor genu RNA polimerazy faga T7 to specyficzna sekwencja 23 bp. System ten jest do╢µ skomplikowany. Sk│ada siΩ z dw≤ch element≤w. W zrekombinowanych kom≤rkach E.coli , zawieraj▒cych gen koduj▒cy T7 RNA polimerazΩ wstawiony za promotorem laktozowym zachodzi synteza du┐ej ilo╢ci RNA polimerazy gdy do po┐ywki dodane jest IPTG. Kom≤rki te s▒ transformowane wektorem plazmidowym , kt≤ry niesie kopiΩ promotora T7 i cDNA genu koduj▒cego wybrane bia│ko. RNA polimeraza wi▒┐e siΩ z promotorem T7 na wektorze plazmidowym co katalizuje transkrypcjΩ wstawionego cDNA.

3. Istniej▒ tak┐e eukariotyczne systemy ekspresyjne. Jest to szczeg≤lnie istotne gdy chcemy otrzymaµ aktywne bia│ko , w kt≤rym prawid│owo zosta│y przeprowadzone modyfikacje posttranslacyjne.

ENZYMY , KT╙RE TNí DNA NA FRAGMENTY I úíCZí JE POZWALAJíC NA NIEZLICZONí ILOª╞ KOMBINACJI TYCH»E.

SCREENING BANKU GEN╙W CZYLI IDENTYFIKACJA ODPOWIEDNIEGO KLONU. SZUKANIE IGúY W STOGU SIANA ?

Webmaster