PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction) polega na przeprowadzeniu wielu cykli syntezy DNA z wykorzystaniem starterów flankuj±cych okre¶lony odcinek DNA o długo¶ci od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów. Jest to metoda alternatywna do klonowania i może być używana w celu amplifikacji nawet bardzo rzadkich sekwencji w mieszaninie ale warunkiem jest znajomo¶ć sekwencji otaczaj±cej powielany fragment. W praktyce wystarczy tylko jedna cz±steczka matrycy.

Typowa reakcja PCR polega na powtarzaj±cych się cyklach :

1. DNA jest denaturowany termicznie w temperaturze około 90°C. Syntetyczne oligonukleotydy długo¶ci mniej więcej 20 nukleotydów komplementarne do 3` końców kawałka DNA , którego powieleniem jeste¶my zainteresowani , dodane s± w dużym nadmiarze molowym do zdenaturowanego DNA.

2. Temperatura zostaje obniżona do 40-60°C. DNA pozostaje zdenaturowany ponieważ komplementarne łańcuchy s± w zbyt niskiej koncentracji , w porównaniu z ilo¶ci± starterów , aby zrenaturować. Specyficzne oligonukleotydy hybrydyzuj± z komplementarnymi sekwencjami w DNA (tzw. annealing) i służ± jako startery do syntezy DNA , któr± prowadzi termostabilna DNA polimeraza tzw. Taq polimeraza izolowana z bakterii Thermus aqaticus.

3. Synteza odbywa się w temperaturze 72°C.

Następnie cała mieszanina jest podgrzewana znowu do 95°C aby rozdysocjować nowo powstałe dupleksy DNA. PóĽniej temperatura jest obniżana i zachodzi następna runda syntezy. W pierwszym cyklu reakcji syntetyzowane s± odcinki DNA o różnej długo¶ci. Stopniowo zaczynaj± przeważać fragmenty ograniczone straterami a końcowy produkt jest praktycznie jednorodny. W każdym cyklu liczba kopii sekwencji pomiędzy primerami ro¶nie wykładniczo jak 2ⁿ gdzie n jest liczb± cykli.

Po powieleniu DNA może być poddany analizie restrykcyjnej , hybrydyzacyjnej czy sekwencjonowaniu.

ZASTOSOWANIE :

PCR może być używany do amplifikacji specyficznych sekwencji na DNA izolowanym nawet z pojedynczej komórki. Ma to ogromne znaczenie przy :

- analizowaniu mutacji zwi±zanych z szeregiem chorób genetycznych

- diagnostyce chorób dziedzicznych

- ustalaniu ojcostwa w s±downictwie

- ustalaniu pochodzenia ¶ladów krwi , włosów itp. w kryminalistyce

- namnażaniu DNA z mumii egipskich czy szcz±tków wymarłych organizmów

- wykrywania we krwi obecno¶ci wirusów takich jak np. HIV.

RODZAJE PCR :

RAPD-PCR - polega na amplifikacji przypadkowo wybranych fragmentów genomu dzięki zastosowaniu krótkich starterów (około 10 nukleotydów) o losowo dobranej sekwencji.

Na pewno zwi±ż± się one z DNA w jakim¶ miejscu a ponieważ jednorazowo do każdej reakcji dodawany jest jeden rodzaj startera zakłada się występowanie sekwencji typu odwróconych powtórzeń w takiej odległo¶ci od siebie w genomie , która pozwoli na wydajn± amplifikację czyli 300 do 1500 par zasad. Elektroforetyczny obraz pr±żków jest charakterystyczny dla osobnika. Ten rodzaj PCR znalazł zastosowanie w okre¶laniu stopnia pokrewieństwa między organizmami a także m.in. w kryminalistyce w celach identyfikacji.

RT-PCR - PCR poł±czona z odwrotn± transkrypcj± czyli materiałem wyj¶ciowym do namnażania jest mRNA a nie jak zazwyczaj DNA.

ZAZĘBIONA PCR - umożliwia zamplifikowanie odcinka DNA zawartego w większym uprzednio namnożonym fragmencie.

PCR in situ - nowa technika pozwalaj±ca na przeprowadzenie reakcji w tkance bez naruszania jej struktury np. na preparacie mikroskopowym.

PCR ILO¦CIOWA - za pomoc± pomiaru intensywno¶ci reakcji barwnych jeste¶my w stanie zmierzyć po okre¶lonej liczbie cykli ilo¶ć powstałego produktu. Jest to szczególnie istotne dla substancji występuj±cych w bardzo niewielkich ilo¶ciach. Można w ten sposób szacować poziom ekspresji genu koduj±cego konkretne białko mierz±c ilo¶ć mRNA.

SEKWENCJONOWANIE - Sˇ JUŻ DO TEGO MASZYNY

WSZYSTKO CO BIOTECHNOLOG MUSI MIEĆ W LABORATORIUM I NIE TYLKO

Webmaster