SEKWENCJONOWANIE - Sˇ JUŻ DO TEGO MASZYNY.

Sekwencjonowanie - metoda , dzięki której możliwe jest ustalenie sekwencji czyli okre¶lenie kolejno¶ci nukleotydów. Jeden z etapów analizy genu. Na podstawie sekwencji istnieje możliwo¶ć przewidzenia kolejno¶ci aminokwasów w białku , które jest kodowane przez dany gen.

S± dwie metody sekwencjonowania :

- Enzymatyczna - metoda Sangera

Na jednoniciowej matrycy syntetyzuje się in vitro DNA. Syteza przebiega od radioaktywnego , oligonukleotydowego startera komplementarnego do 3` końca matrycy. Reakcję wykonuje się równolegle w czterech probówkach , w których oprócz kompletu deoksytrifosforanów nukleotydów (dATP , dCTP , dTTP , dGTP) dodana jest niewielka ilo¶ć jednego z nich w postaci dideoksytrifosforanu nukleotydu , co uniemożliwia kontynuowanie reakcji w momencie wł±czenia takiego nukleotydu w syntetyzowany łańcuch , ponieważ brakuje wtedy grupy hydroksylowej na 3` końcu.

Synteza zostaje zahamowana losowo - powstaje mieszanina fragmentów o różnej długo¶ci.




Produkty reakcji poddawane s± elektroforezie w czterech równoległych ¶cieżkach na żelu poliakrylamidowym. Pozwala to na ustalenie sekwencji nici komplementarnej do badanej.

- Chemiczna - metoda Maxama-Gilberta

Jest to metoda praktycznie już nie stosowana.

Polega na degradacji wyznakowanych na 5` końcu cz±steczek DNA zwi±zkami chemicznymi przecinaj±cymi specyficznie wi±zania fosfodiestrowe za nukleotydem odpowiadaj±cym okre¶lonej zasadzie azotowej. Wynikiem reakcji jest zbiór fragmentów DNA o różnej długo¶ci co spowodowane jest takim doborem warunków , że w poszczególnych cz±steczkach przecinane jest tylko jedno lub dwa wi±zania. Fragmenty z czterech niezależnych reakcji (dGTP , dGTP i dATP , dCTP , dCTP i dTTP) rozdziela się elektroforetycznie po czym poddaje autoradiografii. Pr±żki na autoradiogramie odpowiadaj± fragmentom DNA posiadaj±cym na końcu 5` znakowany fosfor a na końcu 3` okre¶lon± zasadę.

Obydwie metody pozwalaj± na odczytanie sekwencji około 400 do 700 nukleotydów w jednym do¶wiadczeniu. Je¶li sekwencjonujemy dłuższy odcinek należy go poci±ć enzymem restrykcyjnym i ustalać sekwencję każdego fragmentu osobno.



IZOLACJA Z ŻELU CZYLI JAK ODZYSKAĆ DNA

PCR


© 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie                 Webmaster

This server is running Apache