Pojedynczy chromosom prokariotyczny zawiera praktycznie cał± informację genetyczn±. Zdecydowana większo¶ć bakterii ma chromosom kolisty i nie posiada błony oddzielaj±cej go od cytoplazmy co daje możliwo¶ć bliskiego występowania procesu produkcji mRNA na matrycy DNA oraz maszynerii odpowiedzialnej za biosyntezę białek.

W komórkach prokariotycznych procesy transkrypcji i translacji zachodz± jednocze¶nie do tego stopnia, że możliwe jest rozpoczęcie translacji na jednym końcu mRNA zanim zostanie zakończona transkrypcja na drugim końcu.

Kolisty chromosom bakteryjny jest podzielony na kilkadziesi±t pętli, które maj± końce unieruchomione w białkowym szkielecie. Białka występuj±ce w chromosomach bakteryjnych tzw. białka histonopodobne, poza organizowaniem DNA w chromosomie pełni± jeszcze pewne dodatkowe funkcje przypominaj±c działaniem czynniki transkrypcyjne w komórkach eukariotycznych.

Mapa chromosomu bakteryjnego daje pewne wiadomo¶ci o jego organizacji. Poza niektórymi grupami genów skupionymi w operony, nie da się zaobserwować konkretnego wzorca, według którego następowałaby lokalizacja genów w chromosomie bakteryjnym. Transkrypcja operonów może zachodzić dla niektórych w jednym kierunku, a dla innych w przeciwnym.

Miejsce replikacji chromosomu bakteryjnego jest ¶ci¶le okre¶lone tzw.ori (origin of replication) dla każdego typu bakterii, ponadto podobna jest aranżacja genów zarówno w ori jak i w miejscu terminacji syntezy DNA. Poza tym w niektórych bakteriach wydaje się ważne, aby w przypadku pewnych regionów kierunek transkrypcji był taki sam jak kierunek poruszania się widełkek replikacyjnych DNA. (FIG7.33bomicroorg.)

Cz±steczka s bierze udział tylko w formowaniu pocz±tkowego kompleksu polimerazy RNA z DNA i jest odpowiedzialna za rozpoznanie promotorów: sekwencji –35 od miejsca inicjacji i sekwencji Pribnow box w regionie –10 od miejsca inicjacji. W wyniku działania polimerazy RNA w kierunku 5’ à 3’ powstaje mRNA.

U Prokaryota pojedyncza molekuła mRNA często koduje więcej niż jedno białko ze względu na występowanie grup genów zwanych operonami. Polimeraza RNA transkrybuje wtedy wszystkie geny z danego operonu na pojedyncz± molekułę mRNA (tak zwane policystroniczne mRNA). W mRNA u Prokaryota zazwyczaj nie występuj± introny, jednak je¶li już się tam znajd± to s± samoistnie wycinane przez RNA (zwane rybozymem).

tRNA i rRNA powstaj± jako długie cz±steczki prekursorowe, które s± następnie cięte w kilku miejscach w celu utworzenia dojrzałych cz±steczek RNA. mRNA podlega na ogół bezpo¶redniej translacji.

Translacja zachodzi w kilku etapach : inicjacja, elongacja, terminacja, uwolnieni i sfałdowanie polipeptydu przy wykorzystaniu całej maszynerii jak± jest m.in. rybosom. U Prokaryota rybosomy składaj± się z dwóch podjednostek: 30S i 50S daj±cych w poł±czeniu rybosom 70S. Podjednostka 30S zawiera 16S rRNA i około 21 białek, natomiast podjednostka 50S zawiera 5S i 23S rRNA i około 34 białek.

Inicjacja syntezy białek zaczyna się od uformowania kompleksu zawieraj±cego podjednostkę 30S, mRNA, tRNA dla formylometioniny i czynniki inicjatorowe. Do tego kompleksu przył±cza się podjednostka 50S. Zwi±zanie mRNA z rybosomem zależy od tzw. sekwencji Shine-Dalgarno (3 do 9 nukleotydów zlokalizowanych przed kodonem inicjacyjnym na mRNA). Ta sekwencja jest komplementarna do 3’ końca 16S RNA rybosomu i pozwala komórkom prokaryotycznym na translację policystronicznego mRNA.

Proces inicjacji rozpoczyna się przył±czeniem aminoacylo-tRNA do kodonu start. U bakterii inicjatorowym aminoacylo-tRNA jest formylometionina. Terminacja syntezy białek zachodzi gdy osi±gnięty zostanie kodon nonsensowny inaczej zwany kodonem stop. Białka uwalniaj± się, a rybosom dysocjuje na dwie podjednostki.

Zgromadzenie powi±zanych ze sob± funkcyjnie genów bakteryjnych w jednym miejscu zwi±zane jest z regulacj± przeprowadzan± przez specyficzne cz±steczki, umożliwiaj±c± kontrolę ekspresji genów jednego szlaku metabolicznego.

Tego typu regulacja ekspresji genów bakteryjnych bierze się z konieczno¶ci efektywnego wykorzystania ograniczonych zapasów i energii oraz produkcji wył±cznie niezbędnych zwi±zków.

Prawidłowo funkcjonuj±ca komórka bakteryjna nie powinna syntetyzować enzymów do metabolizmu laktozy, jeżeli brak jest laktozy w pożywce. Podobnie bezsensowne byłoby produkowanie enzymów do syntezy tryptofanu je¶li znajdowałby się on w wystarczaj±cej ilo¶ci.

Dlatego też komórki bakteryjne opracowały precyzyjne mechanizmy kontroli syntezy różnych zwi±zków oparte na strukturze ich informacji genetycznej, w której geny odpowiedzialne za konkretny szlak metaboliczny znajduj± się w jednym miejscu i tworz± tzw. operon.

Pierwszym poznanym mechanizmem regulacji operonowej u bakterii jest proces rozkładu laktozy u E.coli. Laktoza jest disacharydem ulegaj±cym rozłożeniu na dwa cukry składowe: galaktozę i glukozę, pod wpływem enzymu beta-galaktozydazy. Je¶li w ¶rodowisku nie ma laktozy, w komórce E.coli znajduje się tylko kilka cz±steczek tego enzymu. Natomiast w momencie gdy w ¶rodowisku znajduje się laktoza, w komórce pojawiaj± się tysi±ce cz±steczek beta-galaktozydazy. Dodatkowo zwiększa się w komórce ilo¶ć pozostałych enzymów zaangażowanych w szlak laktozowy (galaktozydopermeazy i transacetylazy galaktozydowej). Każdy z tych enzymów jest kodowany przez oddzielny gen jednak ich ekspresja ulega wspólnej regulacji. Geny tych trzech enzymów znajduj± się w jednym liniowym odcinku na chromosomie E.coli i zostały oznaczone według kolejno¶ci występowania:

• Z - beta galaktozydaza
• Y - beta galaktozydopermeaza (białko transportowe)
• A - transacetylaza galaktozydowa.

Ekspresja wszystkich trzech genów podlegać może jednoczesnej indukcji przez cz±steczkę laktozy. Na tej podstawie stwierdzono, że przed tymi genami musi się znajdować niezależny element genetyczny, który reguluje ich ekspresję.

W końcu okazało się, że w regulacji bierze udział kilka genów:

• gen regulatorowy (gen lacI), który koduje cz±steczkę represora zdoln± do przej¶cia w inne miejsce, do operatora, gdzie indukuje ona sygnał wył±czaj±cy operon
• gen operatora, który otrzymuje sygnał wył±czaj±cy z represora
• trzy geny koduj±ce białka, które s± transkrybowane na jedno mRNA
• miejsce promotora (czę¶ciowo nachodz±ce na gen operatorowy), gdzie przył±cza się RNA polimeraza i indukuje syntezę mRNA

Operon laktozowy, lac, działa w następuj±cy sposób. Gen regulatorowy produkuje cz±steczkę represora, która może przenie¶ć się do miejsca występowania operatora, przył±czyć się do niego i zahamować transkrypcję genów strukturalnych w tym operonie.

Jeżeli w pobliżu nie ma cz±steczek laktozy, cz±steczka represora przyjmuje konformację zdoln± do zwi±zania się z operatorem. Gdy represor zwi±że się z operatorem, promotor jest czę¶ciowo zasłonięty, wobec czego polimeraza RNA nie może się z nim zwi±zać i nie dochodzi do transkrypcji mRNA a następnie syntezy trzech białek.

Jeżeli natomiast w ¶rodowisku obecna jest laktoza, represor wi±że się z ni± i przyjmuje inny kształt, który nie pozwala na poł±czenie się z operatorem. Promotor pozostaje odsłonięty, wi±że się z polimeraz± RNA i dochodzi do ekspresji genów, które następnie prowadz± do rozkładu laktozy.

Jest to przykład regulacji genów na poziomie transkrypcyjnym.

FIG 14-10 z Hopsona p. 314 An inducible operon

Ten mechanizm jest prosty i ładnie tłumaczy dlaczego komórka E.coli produkuje tylko tyle beta-galaktozydazy ile jest jej potrzebne. Jednak w rzeczywisto¶ci sytuacja staje się nieco bardziej skomplikowana gdyż komórka bakterii może jednocze¶nie otrzymać laktozę i glukozę. Co wtedy?

Dla bakterii korzystniejsze jest rozłożenie glukozy niż laktozy, ponieważ glukoza może być natychmiast zużyta w metabolizmie, a laktoza musi zostać najpierw rozłożona w skomplikowanych reakcjach chemicznych.

Bakteria zdolna do zużycia glukozy pomimo obecno¶ci laktozy w pożywce będzie rosła szybciej niż inne bakterie tym samym zdobywaj±c pewn± nad nimi przewagę.

Dlatego też nie należy się dziwić, że powstał mechanizm tzw. represja kataboliczna, który umożliwia bakterii zużywanie na pocz±tku glukozy nawet gdy jest laktoza. Mechanizm represji katabolicznej opiera się na fakcie, że polimeraza RNA ł±czy się z promotorem w operonie lac dużo lepiej w obecno¶ci specyficznego białka CAP (catabolite gene activator protein), które musi być zwi±zane ze specyficznym miejscem DNA położonym w pobliżu tzw.CBS (CAP binding site). Białko CAP wi±że się z tym miejscem je¶li do tego białka przył±cz± się cz±steczki cAMP, co zachodzi przy braku glukozy.

Jeżeli natomiast glukoza znajduje się w pożywce, spada poziom cAMP, białko CAP zmienia kształt, nie wi±że się z CBS, polimeraza RNA gorzej wi±że się z promotorem i synteza enzymów szlaku laktozowego zostaje spowolniona.

Fig14-11 p.315 Represja kataboliczna Biology Wessels Hopson

Istniej± więc trzy różne poziomy aktywno¶ci operonu lac, zależne od obecno¶ci laktozy i glukozy w pożywce oraz regulowane przez trzy różne białka: lac represor, polimerazę RNA i CAP.

Najniższy poziom ekspresji zachodzi pod nieobecno¶ć laktozy: nie ma substratu, niepotrzebne s± enzymy do katalizy, represor lac jest poł±czony z operonem i blokuje wi±zanie się polimerazy RNA.

Najwyższy poziom ekspresji obserwuje się przy obecno¶ci laktozy, lecz braku glukozy: laktoza wi±że represor uniemożliwiaj±c mu zwi±zanie się z operatorem, co z kolei pozwala na przył±czenie polimerazy RNA, a dodatkowo wysoki poziom cAMP i ł±czenie się go z CAP i CAP z CBS co w rezultacie uaktywnia polimerazę RNA.

Model regulacji rozkładu laktozy w operonie lac jest jednym z wielu jakie funkcjonuj± w komórkach bakteryjnych. Jest to przykład pozytywnej regulacji ekspresji gdyż obecno¶ć substratu w pożywce indukuje produkcję enzymów.

Ponadto mamy do czynienia z innymi modelami regulacji ekspresji genów również wynikaj±cymi z d±żenia komórki do efektywnego wykorzystania surowców ale jednocze¶nie nie nadprodukowania jakiej¶ substancji bez wyraĽnej potrzeby. Ten typ mechanizmu regulacji to represja czyli zahamowanie syntezy enzymów szlaku biosyntetycznego w odpowiedzi na nadmiar końcowego produktu. Przykładem operonu regulowanego w ten sposób jest operon tryptofanowy (trp).

Operon ten zawiera pięć genów (E,D,C,B,A) koduj±cych enzymy, które prowadz± do syntezy aminokwasu - tryptofanu. W przypadku operonu tryptofanowego również mamy do czynienia z cz±steczk± represora kodowan± w niewielkiej odległo¶ci od operonu. Cz±steczka represora trp podobnie jak lac może istnieć w dwóch konformacjach: jedna powoduje ł±czenie z operatorem i zablokowanie transkrypcji, natomiast druga konformacja nie pozwala na zwi±zanie się represora z operatorem i umożliwia zaj¶cie transkrypcji.

W obecno¶ci tryptofanu cz±steczka represora wi±że się z tym aminokwasem i zmienia konformację, na tak± która umożliwia zwi±zanie się z operatorem i zablokowanie syntezy enzymów.

Jeżeli tryptofan jest nieobecny, represor nie może zwi±zać się z operatorem. Dochodzi wtedy do przył±czenia polimerazy RNA i syntezy enzymów, które w następstwie doprowadz± do syntezy tryptofanu.

Oba opisane mechanizmy regulacji ekspresji genów czyli indukcja operonu lac i represja operonu trp s± przykładami na kontrolę negatywn±. Oznacza to, że ekspresja genów podlegaj±cych takiej kontroli zachodzi dopóki nie zostanie wył±czona przez cz±steczkę represora.

Istnieje jeszcze model pozytywnej regulacji ekspresji genów, co z kolei oznacza, że geny znajduj±ce się pod tak± kontrol± ulegaj± ekspresji dopiero pod wpływem działania specyficznego białka regulatorowego. Przykładem tego typu regulacji może być opisana już wcze¶niej aktywacja kompleksu promotor-polimeraza RNA operonu lac przez wi±z±nie się białka CAP do CBS.

Innym przykładem regulacji pozytywnej jest katabolizm maltozy u E.coli. Enzymy do rozkładu maltozy s± syntetyzowane dopiero po dodaniu maltozy do pożywki. Ich synteza jest regulowana na poziomie transkrypcji przez białko aktywuj±ce (AP-activator protein). AP nie może zwi±zać się z DNA dopóki nie poł±czy się z cz±steczk± maltozy. Gdy AP zwi±że się z cz±steczk± maltozy, kompleks taki ł±czy się z DNA i umożliwia polimerazie RNA rozpoczęcie transkrypcji. Aktywator podobnie jak represor rozpoznaje specyficzn± sekwencję DNA tzw. miejsce wi±zania aktywatora. Geny potrzebne do katabolizmu maltozy znajduj± się w kilku operonach wobec czego aktywator kontroluje więcej niż jeden operon. Grupa operonów regulowanych przez jedno białko aktywuj±ce nazywana jest regulonem.

Atenuacja jest typem regulacji opartym na fakcie, że w organizmach prokariotycznych transkrypcja i translacja s± procesami wzajemnie poł±czonymi. Atenuacja została zaobserwowana w niektórych operonach kontroluj±cych biosyntezę aminokwasów.

Najlepiej zbadanym przykładem jest atenuacja w operonie tryptofanowym. Poza wspomnianymi już wcze¶niej genami i strukturami znajduj±cymi się w tym operonie, operon ten zawiera tzw. sekwencję liderow± w obrębie której znajduje się region atenuatora koduj±cy polipeptyd zawieraj±cy przy końcu kodony tryptofanu. Jeżeli w komórce znajduje się dużo tryptofanu peptyd liderowy zostanie zsyntetyzowany. Natomiast przy braku tryptofanu nie powstanie peptyd liderowy. Jakie s± tego rezultaty?

Synteza peptydu liderowego prowadzi do zahamowania transkrypcji genów tryptofanowych. W jaki sposób?

Proces ten jest możliwy ze względu na fakt, że transkrypcja i translacja w komórkach bakterii zachodzi praktycznie jednocze¶nie. Sekwencja liderowa jako pierwsza ulega transkrypcji i gdy następnie transkrypcja idzie dalej, mRNA sekwencji liderowej ulega już translacji. Jednakże w przypadku mRNA sekwencji liderowej, gdy jest już uwolnione z DNA i poł±czy się z rybosomem ulega ono sfałdowaniu w podwójn± pętlę, która sygnalizuje zatrzymanie transkrypcji dalszych genów (tryptofanowych).

Je¶li nie ma tryptofanu to nie dojdzie do translacji całej sekwencji liderowej gdyż zostanie ona zatrzymana na kodonie tryptofanowym, co powoduje przyjęcie innej konformacji przez mRNA sekwencji liderowej. Ta konformacja nie blokuje polimerazy RNA, która przechodzi dalej do transkrypcji genów tryptofanowych. Mechanizmy represji i atenuacji operonu tryptofannowego w precyzyjny sposób kontroluj± syntezę enzymów szlaku biosyntezy tryptofanu.

Podobne modele atenuacji odkryto w innych szlakach metabolicznych bekterii np. w biosyntezie histydyny czy fenyloalaniny.

Większo¶ć systemów kontroluj±cych czy to transkrypcję czy translację wykorzystuje białka jako cz±steczki regulatorowe. Jednak niekiedy zdarza się, że w regulację zostanie zaangażowane RNA.

Jednym z rodzajów regulatorowego RNA jest RNA antysensowne używane w kontroli różnych genów bakteryjnych. Antysensowne RNA oddziałuje jako regulator poprzez parowanie z komplementarn±, sensown± nici± RNA. Jeżeli t± komplementarn± nici± jest mRNA, to parowanie z antysensownym RNA może zapobiec zaj¶ciu translacji.

Antysensowne RNA może być syntetyzowane z tego samego genu co mRNA przez zastosowanie drugiego promotora zorientowanego w przeciwnym kierunku do pierwszego lub poprzez drugi gen z promotorem na przeciwnym końcu.

Plazmidy s± to elementy genetyczne zdolne do autonomicznego powielania się i istnienia pozachromosomalnego. Większo¶ć plazmidów ma koliste, superzwinięte dsDNA, a niektóre liniowe dsDNA. Wiele plazmidów może być przenoszonych w procesie koniugacji z jednej do drugiej komórki. Niektóre plazmidy maj± zdolno¶ć do wintegrowywania się w chromosom bakteryjny i wtedy ich replikacja podlega kontroli bakterii.

W genomie wirusa kodowane s± niektóre enzymy niezbędne do jego replikacji jednak reszta czyli: systemy zapewniaj±ce energię, rybosomy, tRNA (z pewnymi wyj±tkami) oraz enzymy aktywuj±ce aminokwasy s± dostarczane przez komórkę gospodarza.

FIG 6-9 p 194.

(Powyżej opisany proces dotyczy wirusów bakteryjnych).

Pierwszy etap replikacji wirusa charakteryzuje się duż± specyficzno¶ci± interakcji pomiędzy wirusem a gospodarzem. Cz±steczka wirusa posiada na swojej powierzchni białka, które oddziałuj± ze specyficznymi elementami powierzchniowymi na komórce zwanymi receptorami. Zwykle pełni± one w komórce normalne funkcje np. białka transportowe czy białka otoczki bakteryjnej lub w przypadku grypy jest to glikoproteina na erytrocytach.

Je¶li receptor nie występuje lub jest zmieniony, wirus nie może adsorbować i infekcja nie zajdzie - gospodarz staje się odporny na wirusa, oczywi¶cie dopóki w wirusie nie zajdzie mutacja umożliwiaj±ca mu adsorpcję do zmutowanego receptora.

Przył±czanie się wirusa może zachodzić również na niespecyficznej drodze poprzez fagocytozę lub inne procesy endocytozy (powszechne w¶ród wirusów zwierzęcych i ro¶linnych).

Proces penetracji wirusa do wewn±trz komórki gospodarza zależny jest od charakteru tej komórki, szczególnie od jej struktur powierzchniowych w wyniku czego penetracja zachodzi inaczej w komórkach zwierzęcych pozbawionych ¶ciany komórkowej niż w ro¶linnych i bakteryjnych.

Przykładem skomplikowanego mechanizmu penetracji jest infekcja komórki E.coli bakteriofagiem T4 (FIG 6.11) Wirion T4 posiada strukturę głowow±, osadzon± na ogonku, który kończy się zestawem włókien ogonowych. Włókna te jako pierwsze przył±czaj± się do powierzchni komórki a następnie obkurczaj± co powoduje zbliżenie się rdzenia ogonka do powierzchni komórki. Enzym wirusowy o charakterze lizozymu powoduje powstanie niewielkiego otworu w ¶cianie komórkowej, przez który wnika DNA wirusowe.

Na tym etapie istnieje jeszcze możliwo¶ć usunięcia kwasu nukleinowego wirusa poprzez działanie enzymów restrykcyjnych znajduj±cych się na terenie komórki. Jednakże wirusy "nauczyły się" przeciwdziałać temu procesowi; modyfikuj±c kwasy nukleinowe w podobny sposób jak komórki gospodarza lub hamuj±c działanie systemów restrykcyjnych przez specyficzne białka.

W celu powstania nowych białek wirusowych musz± zostać utworzone specyficzne mRNA. Synteza mRNA wirusowego zależy od typu wirusa i jego materiału genetycznego. FIG6.12 p196.

W przypadku gdy informację genetyczn± wirusa stanowi RNA możliwe jest kilka rozwi±zań dla produkcji mRNA. Gdy mamy do czynienia z wirusem zawieraj±cym jednoniciowe RNA pozytywne (+), oznacza to, że służy ono bezpo¶rednio jako mRNA. W tym RNA kodowana jest między innymi polimeraza RNA specyficzna dla wirusa. Polimeraza ta pocz±tkowo powoduje powstanie negatywnej nici komplementarnej, która następnie służy jako matryca do wytworzania większej ilo¶ci nici pozytywnych.

Je¶li natomiast wyj¶ciowym materiałem genetycznym jest jednoniciowe RNA negatywne (-) lub dwuniciowe RNA sytuacja się nieco komplikuje, gdyż nie może ono pełnić bezpo¶rednio funkcji mRNA. Aby powstało mRNA konieczna jest RNA-zależna polimeraza RNA, która występuje w wirusach i prowadzi do syntezy mRNA.

Retrowirusy (wirusy RNA) replikuj± się dzięki po¶rednictwu DNA. Proces kopiowania informacji genetycznej z RNA na DNA jest to odwrotna transkrypcja i zachodzi on pod wpływem enzymu tzw. odwrotnej transkryptazy. Po zainfekowaniu komórki, RNA wirionu kopiowane jest na dwuniciowe DNA (dsDNA) z przej¶ciem przez etap ssDNA. Następnie dsDNA służy jako matryca do syntezy mRNA.

Gdy mamy już mRNA możliwa jest synteza białek wirusowych. Białka te należ± do trzech głównych grup:

• wczesne białka o charakterze enzymatycznym, niezbędne do replikacji kwasu nukleinowego wirusa, syntetyzowane w niewielkich ilo¶ciach
• póĽne białka czyli m.in. białka płaszcza wirusowego, białka strukturalne, syntetyzowane w dużych ilo¶ciach
• białka lityczne, które umożliwiaj± otworzenie komórki gospodarza i uwolnienie cz±steczek wirusa.

Istnieje ogromna liczba wirusów bakteryjnych, wiele z nich ma skomplikowan± strukturę, tylko niektóre posiadaj± lipidow± otoczkę. Większo¶ć badanych wirusów atakuje E.coli lub Salmonella typhimurium.

Bakteriofagi RNA

Najlepiej poznane bakteriofagi RN-owe zawieraj± jednoniciowe RNA. U Enterobacteriaceae bakteriofagi infekuj± tylko komórki odgrywaj±ce rolę donorów w procesie rekombinacji genetycznej co zwi±zane jest z występowaniem na tych komórkach specyficznech pili, będ±cych jednocze¶nie receptorami dla cz±steczek tych wirusów.

Bakteriofagi te, s± niewielkie (ok. 26 nm) i maj± symetrię ikosaedraln±. Niektóre genomy tych bakteriofagów zostały już poznane np. MS2 ma genom o długo¶ci 3569 nukleotydów, nić RNA (+), która działa bezpo¶rednio jako mRNA. W komórce gospodarza mRNA wchodzi do rybosomu i produkowane s± cztery typy białek; dojrzało¶ci, odpowiedzialne za lizę, strukturalne do budowy płaszcza oraz replikaza RNA (kombinacja polipeptydów wirusa i gospodarza). Ciekawostk± jest, że gen białka odpowiedzialnego za lizę komórki gospodarza nachodzi zarówno na gen białka płaszczowego jak i na gen replikazy, co w rezultacie powoduje, że rozpoczęcie translacji tego genu jest niemożliwe dopóki nie powstanie odpowiednia ilo¶ć białka płaszczowego.

Bakteriofagi ssDNA maj± genom w formie zamkniętego koła o ¶rednicy ok. 25 nm, płaszcz zbudowany z pojedynczego białka w 60 kopiach, do którego doł±czone s± inne białka tworz±ce strukturę szpikulcopodobn±.

Bakteriofagi te, w przeciwieństwie do poprzednich, podczas replikacji korzystaj± głównie z maszynerii komórkowej i posiadaj± we własnym genomie jedynie podstawowe informacje dotycz±ce białek kapsydowych, szpikulcowych czy powoduj±cych lizę komórki bakteryjnej.

Najpowszechniej badany wirus z tej grupy to f X174, atakuj±cy E.coli, w którym po raz pierwszy odkryto geny nachodz±ce na siebie (ang. overlapping genes). Geny te stanowi± rozwi±zanie problemu małej ilo¶ci DNA koduj±cego, pozwalaj±c na bardziej efektywne wykorzystanie informacji genetycznej, ale jednocze¶nie stwarzaj± niebezpieczeństwo, że jedna mutacja może wpłyn±ć na dwa geny.

FIG 6.17

Replikacja tego wirusa zachodzi według modelu obracaj±cego się koła (rolling circle replication). Najpierw jednak dochodzi do powstania RF, czyli replikacyjnej formy DNA. Jest to superzwinięte dsDNA, które powstaje wskutek działania komórkowych enzymów na ssDNA wirusa.

Następne RF tworzone s± w konwencjonalny sposób poprzez semikonserwatywn± replikację z po¶rednimi formami theta, ale utworzenie genomu ssDNA zachodzi według wspomnianego wyżej modelu. FIG 6-18.

Jedna nić zostaje przerwana i koniec 3' używany jest do rozpoczęcia syntezy nowej nici. Synteza ta jest asymetryczna ponieważ tylko jedna z nici jest matryc±. Gdy zostanie osi±gnięta odpowiednia długo¶ć odpowiedni enzym przecina i ł±czy dwa końce nowej nici.

Wiele wirusów zawiera materiał genetyczny w postaci podwójnej nici DNA (dsDNA). Były to pierwsze odkryte wirusy bakteryjne i s± one bardzo intensywnie badane.

Bakteriofag T7 jest wirusem atakuj±cym E.coli, posiada ikosaedraln± główkę i mały ogonek. Jego genom został zsekwencjonowany i zbadany. Okazało się, że czę¶ć genów nachodzi na siebie i ich kolejno¶ć wpływa na regulację powielania wirusa.

DNA wirusowe wchodzi liniowo do komórki gospodarza, zaczynaj±c od lewego końca i następuje natychmiastowa transkrypcja kilku genów na tym końcu dzięki komórkowej RNA polimerazie.

Powstaj± nachodz±ce na siebie policystroniczne mRNA, które zostaj± przecięte przez komórkow± Rnazę, daj±c mniejsze mRNA koduj±ce: białka hamuj±ce system restrykcyjny gospodarza oraz wirusow± RNA polimerazę, a także białka hamuj±ce RNA polimerazę komórki gospodarza.

Gdy zostaje zahamowana polimeraza komórki bakteryjnej (kontrola negatywna), zakończona jest transkrypcja wczesnych genów T7. Natomiast fagowa polimeraza rozpoznaje tylko pozostałe promotory na genomie T7 prowadz±c do syntezy reszty białek faga.

Replikacja DNA zaczyna się w ori sk±d odbywa się w obu kierunkach jednocze¶nie, przy zastosowaniu dwóch typów primerów RNA ; w lewo primer syntetyzowany przez primazę T7, w prawo syntetyzowany przez T7 RNA polimerazę. Oba primery podlegaj± wydłużaniu przez fagow± polimerazę DNA. FIG6.21

Wirus T7 posiada pewn± cechę strukturaln± tzw. dtr (direct terminal repeat o długo¶ci ok.160bp, na 5’ końcach cz±steczki) przydatn± podczas replikacji. W celu zakończenia replikacji na 5’ końcu DNA primery RNA musz± zostać usunięte. Na obu końcach DNA faga T7 zostaj± pewne fragmenty, które nie uległy replikacji. T7 “rozwi±zuje” ten problem przy użyciu wspominanych już sekwencji dtr. Na obu niciach 3’ DNA znajduj± się sekwencje komplementarne do dtr i ł±cz± się z nimi tworz±c cz±steczkę o podwojonej długo¶ci w porównaniu do normalnego T7. Niezreplikowane do tej pory fragmenty DNA zostaj± uzupełnione dzięki działaniu polimerazy i ligazy DNA co prowadzi do utworzenia tzw. konkatameru. Konkatamer zostaje pocięty na cz±steczki o długo¶ci odpowiadaj±cej wirusowi T7 przez specjalny enzym.

Największe i najbardziej skomplikowane fagi zarówno pod względem struktury jak i replikacji należ± do tzw. grupy fagów T-parzystych.

Przykładowym fagiem z tej grupy jest T4, maj±cy ikosaedraln± główkę wydłużon± przez dodatkowe białka oraz zróżnicowany strukturalnie ogonek. W genomie T4 znajduje się nietypowy nukleotyd 5-hydroksymetylocytozyna (dodatkowo glukozylowany) zamiast cytozyny, który powoduje że dane DNA jest odporne na restrykcyjne endonukleazy bakteryjne. DNA T4 występuje w formie liniowej jednak jego mapa genetyczna przedstawiana jest w formie kołowej.

Proces replikacji DNA T4 jest podobny do T7 jednakże enzym tn±cy DNA na jednakowe fragmenty liniowe nie jest specyficzny do sekwencji co powoduje powstawanie zróżnicowanych końcow cz±steczki i nieco dłuższych genomów wirusowych.

Geny fagaT4 koduj± dwie podstawowe grupy białek; wczesne, czyli enzymy zaangażowane w proces replikacji i transkrypcji, oraz póĽne czyli białka strukturalne główki i ogonka, a także enzymy uwalniaj±ce faga z komórki. Fag T4 korzysta w trakcie syntezy z polimerazy RNA występuj±cej w komórce bakteryjnej. Formowanie główki i ogonka zachodzi niezależnie, DNA zostaje upakowane w główce nastepnie przył±cza się ogonek i fag gotowy jest do opuszczenia komórki. Liza ¶ciany komórkowej bakterii zachodzi pod wpływem lizozymu, który atakuje peptydoglikany komórkowe. Cały proces może trwać około 25 minut.fig6.24

Większo¶ć wirusów bakteryjnych przechodzi cykl lityczny prowadz±cy do zabicia komórki bakteryjnej. Jednakże jest wiele wirusów, które pomimo możliwo¶ci zabicia komórki wybieraj± drogę lizogeniczn± czyli łagodn± kiedy to większo¶ć genów faga nie ulega ekspresjii a genom fagowy wbudowany do bakteryjnego ulega synchronicznej replikacji i wraz z podziałami komórkowymi jest przekazywany następnym pokoleniom bakterii. FIG 6.25 koniecznie Bakteria zainfekowana wirusem w łagodnej postaci jest odporna na następne ataki nowych cz±steczek tego wirusa.

Wirusy łagodne istniej± w komórkach zazwyczaj w formie zwanej prowirusem. Prowirus posiada tak± sam± informację genetyczn± jak wirus. Jednak jest ona zablokowana przez specjalny fagowy represor i nie ulega ekspresji. Ta sytuacja może ulec zmianie pod wpływem specyficznych czynników (np.UV, promieniowanieX) powoduj±cych inaktywację represora - indukcja lizogeniczna.

Wirus łagodny może istnieć w dwóch formach zależnych od warunków. Czasem jako niezależna jednostka, kontroluj±ca swoj± replikację (cykl lityczny), lub jako DNA wintegrowane w materiał genetyczny komórki gospodarza (cykl łagodny - lizogeniczny).

Najlepiej poznanym wirusem łagodnym jest lambda atakuj±ca E.coli, zawiera on dsDNA w formie liniowej z 12-nukleotydowymi jednoniciowymi, komplementarnymi ogonami na 5' końcach, które ł±cz± sie formuj±c dwuniciow± kolist± cz±steczkę.

Genom faga lambda zawiera dwa zestawy genów; jeden - kontroluj±cy cykl lityczny, drugi - lizogeniczny. Podczas infekcji dochodzi do zapocz±tkowania ekspresji genów obu cykli. Fag lambda zawiera kilka operonów.

Po wprowadzeniu wirusa do komórki zapocz±tkowana zostaje transkrypcja jego genów. Produktem genu cI jest białko cI będ±ce represorem transkrypcji genów zaangażowanych w cykl lityczny. Je¶li represor zgromadzi się w komórce zanim ulegn± ekspresji geny lityczne to zahamuje on cykl lityczny.

Powodem dla którego liza nie zawsze zostaje zahamowana jest istnienie białka Cro będ±cego produktem genu cro. Kluczem do zrozumienia tego procesu jest położenie genów koduj±cych te dwa białka. Te dwa geny leż± blisko siebie, s± transkrybowane w przeciwnych kierunkach a pomiędzy nimi znajduj± się promotory i operatory do których mog± się wi±zać produkty obu genów. Gdy represor lambda jest zwi±zany ze swoim operatorem, zasłania on promotor cro. Natomiast gdy białko Cro jest zwi±zane ze swoim operatorem zasłania ono jeden z promotorów dla cI.

W cyklu lizogenicznym następuje ci±gła ekspresja genu cI. Produkt czyli represor wi±że się z dwoma operatorami na DNA i wył±cza transkrypcję reszty genów faga lambda (kontrola negatywna), jednocze¶nie indukuje syntezę samego siebie (kontrola pozytywna). W ten sposób represor zapewnia zahamowanie ekspresji innych genów koniecznych do wzrostu i reprodukcji faga.

W komórce lizogenicznej powielenie faga może zaj¶ć tylko w przypadku inaktywacji represora, co jest możliwe przy zastosowaniu czynników niszcz±cych DNA. Jednym z rezultatów działania takich czynników jest zmiana białka RecA ( w normalnych warunkach bior±cego udział w rekombinacji genetycznej) w specyficzn± proteazę, która bierze udział w zniszczeniu represora. W momencie gdy represor jest zdezaktywowany, może już zachodzić transkrypcja pozostałych genów faga lambda do tej pory zablokowanych, co w rezultacie prowadzi do lizy komórki.

FIG 6.25, 27

DNA faga lambda integruje w chromosom gospodarza w postaci kolistej w specyficznym miejscu na chromosomie tzw.att (bacterial attachment sites) dzięki enzymowi integrazie (kodowanym przez fagowy gen int).

Podczas wzrostu komórki system represji faga lambda uniemożliwia zaj¶cie lizy komórki, natomiast w trakcie replikacji DNA gospodarza zachodzi równoczesna replikacja DNA faga i w komórce potomnej dochodzi do uruchomienia cyklu produktywnego.

Fag lambda używany jest jako wektor w inżynierii genetycznej, do konstruowania hybryd DNA z enzymami restrykcyjnymi. Fag lambda zawiera długi region DNA, który dzięki temu, że nie pełnie żadnych istotnych funkcji w replikacji może być zastępowany obcym DNA.

Bakteriofag Mu jest jednym z bardziej interesuj±cych fagów ze względu na jego możliwo¶ć replikacji jako ruchomego elementu genetycznego. Mu jest wyj±tkowo mutagenny, ponieważ może integrować w ¶rodku genu komórki gospodarza inaktywuj±c go, ponadto ma zdolno¶ć do przemieszczania się w genomie.

Wirusy zwierzęce posiadaj± materiał geneyczny zarówno w formie RNA jak i DNA. Jedn± z ważniejszych grup wirusów zwierzęcych s± retrowirusy, gdyż powoduj± one choroby bardzo groĽne dla człowieka (AIDS). Wirusy dzieli się na różne grupy w zależno¶ci od typu kwasu nukleinowego, obecno¶ci otoczki i niekiedy według stosowanego modelu replikacyjnego.

FIG6.35

Wirusowa infekcja komórki zwierzęcej może mieć rożne efekty. Wirus może spowodować rozpadnięcie się komórki, trwał± infekcję z powolnym uwalnianiem cz±steczek wirusa lub infekcję utajon± kiedy to symptomy pojawiaj± się ze znacznym opóĽnieniem w stosunku do czasu infekcji. Ponadto wirusy mog± powodować powstawanie nowotworów.

FIG6.36

Do tej grupy wirusów należ±: wirus polio, hepatitis A, wirusy przeziębieniowe. W małych wirusach RNA takich jak polio, RNA działa bezpo¶rednio jako pojedyncze mRNA korzystaj±c z translacyjnej maszynerii komórkowej produkuje pojedyncz± dług± poliproteinę, która następnie zostaje pocięta na liczne małe białka niezbędne w procesie powielania kwasu nukleinowego (polimeraza RNA) oraz powstania nowej cz±steczki wirusa (np. białka strukturalne). Synteza białek komórkowych zostaje zahamowana.

W tych wirusach RNA nie odgrywa bezpo¶rednio roli mRNA. Najpierw jest ono kopiowane przez RNA-zależn± polimerazę RNA pochodzenia wirusowego dzięki czemu powstaje mRNA następnie wykorzystywane do syntezy białek wirusowych, które prowadz± do replikacji genomu wirusowego i powstania nowych cz±steczek wirusa. FIG6.39

Przykładem wirusa tego typu jest ludzki wirus grypy, ponadto rhabdowirusy.

W¶ród wirusów DN-owych można wyróżnić cztery główne rodziny; papovawirusy, wirusy herpes, pox i adenowirusy. Spo¶ród nich wszystkie poza wirusami pox przechodz± replikację w j±drze komórkowym, natomiast pox nietypowo powiela się w cytoplazmie.

Niektóre wirusy z grupy papovawirusów maj± zdolno¶ć do indukowania transformacji nowotworowej komórek gospodarza. Gdy wirus tego typu infekuje komórkę, mog± zaj¶ć dwa typy replikacji w zależno¶ci od komórki. W komórkach pierwszego typu infekcja wirusa polega na tworzeniu nowych wirionów i lizie komórki gospodarza. W drugim typie komórek nie dochodzi do wielokrotnego powielenia wirionu, lecz DNA wirusowe integruje w genomie niektórych komórek prowadz±c do genetycznej modyfikacji, która w konsekwencji może spowodować transformację komórki i brak zahamowania jej wzrostu. Przykładem takiego wirusa jest SV40 posiadaj±cy zdolno¶ć do indukowania nowotworów w komórkach zwierzęcych FIG.6.44

Wirusy herpes s± duż± grup± dsDNA wirusów powoduj±cych wiele chorób u zwierz±t i człowieka (np. ospę wietrzn±), maj± zdolno¶ć do pozostawania w formie utajonej w komórkach gospodarza, niektóre mog± prowadzić do transformacji nowotworowej (np.wirus Epsteina-Barra).

Najbardziej skomplikowane i największe wirusy zwierzęce należ± do grupy wirusów pox. Unikatow± wla¶ciwo¶ci± tych wirusów jest zdolno¶ć do przeprowadzania replikacji DNA na terenie cytoplazmy komórki gospodarza. Do tej grupy należy wirus ospy, który jako pierwszy został szczegółowo zbadany, oraz wirus krowianki (cowpox), który powoduje bardzo łagodn± i niegroĽn± infekcję w komórkach ludzkich. Wirus krowianki służy jako szczepionka przeciw ospie oraz jest używany w eksperymentach genetycznych do wprowadzania obcych genów do komórek zwierzęcych i ludzkich.

Adenowirusy zostały po raz pierwszy wyizolowane z migdałków, powoduj± one łagodne infekcje dróg oddechowych i występuj± często w zdrowych osobnikach.

Jedn± z najbardziej skomplikowanych i niew±tpliwie najciekawszych grup wirusów zwierzęcych s± retrowirusy. Przyczyn, dla których znajduj± się one w centrum zainteresowania jest wiele.

Po pierwsze, to one zostały pocz±tkowo zidentyfikowane jako czynniki indukuj±ce powstawanie nowotworów. Po drugie, jeden z retrowirusów jest przyczyn± jednej z najgroĽniejszych i najbardziej kontrowersyjnych współcze¶nie chorób czyli AIDS.

Ponadto mog± one specyficznie wintegrowywać w genom komórki gospodarza przez po¶rednicze DNA. Proces ten jest badany pod k±tem wprowadzania obcych genów do komórek w terapii genowej.

Poza tym retrowirusy posiadaj± enzym - odwrotn± transkryptazę, która stosuj±c RNA jako matrycę kopiuje informacje genetyczn± z RNA na DNA. Enzym ten jest powszechnie stosowany w inżynierii genetycznej. Należy tutaj zaznaczyć, że odwrotna transkryptaza nie jest "narzędziem" zarezerwowanym wył±cznie dla retrowirusów - posiadaj± j± także retrotranspozony u Eukaryota czy E.coli.

Retrowirusy posiadaj± otoczkę o nieokre¶lonej symetrii. Genom retrowirusów ma bardzo nietypow± budowę. Składa się on z dwóch jednakowych pojedynczych nici RNA (+) , poł±czonych wi±zaniami wodorowymi poprzez parowanie nukleotydów ze specyficznymi cz±steczkami tRNA. 5' koniec RNA posiada cap natomiast 3' koniec posiada ogon poly(A) wobec czego RNA mogłoby służyć bezpo¶rednio jako mRNA, jednak tak się nie dzieje.

Ogólnie proces replikacji retrowirusów zachodzi w kilku etapach. Na pocz±tku wirus dostaje się do komórki, następnie jedna z nici RNA jest odwrotnie transkrybowana w ssDNA które zostaje przekształcone w liniowe dsDNA przez odwrotn± transkryptazę. Kolejnym etapem jest wintegrowanie powstałego dsDNA retrowirusa w genom komórki gospodarza. Potem zachodzi transkrypcja DNA wirusowego, powstajemRNA i "potomne" wirusowe RNA, które zostaje upakowane w kapsydzie na terenie cytoplazmy. W końcu nowe cz±steczki wirusa s± odp±czkowywane z błony cytoplazmatycznej i uwalniane z komórki. FIG 6.48.49.50.

Pierwszym etapem po wej¶ciu wirusa do komórki jest transkrypcja RNA na DNA przy zastosowaniu odwrotnej transkryptazy. Enzym ten wykazuje kilka rodzajów aktywno¶ci; synteza DNA z wykorzystaniem RNA jako matrycy (odwrotna transkryptaza), synteza DNA z wykorzystaniem DNA jako matrycy (polimeraza DNA) oraz degradowanie nici RNA w hybrydzie RNA-DNA (rybonukleaza H). Jak wszystkie polimerazy DNA enzym ten wymaga primeru do syntezy DNA.

W reakcji przeprowadzanej przez odwrotn± transkryptazę primerem jest specyficzne tRNA komórkowe. Rodzaj użytego tRNA jest zwi±zany z typem wirusa i pochodzi z ostatniej komórki gospodarza. Przy użyciu danego tRNA jako primeru około 100 nukleotydów RNA z

5'końca jest odwrotnie transkrybowanych na DNA. Gdy transkrypcja dojdzie do 5' końca, zostaje ona zatrzymana.

W celu skopiowania pozostałej większo¶ci RNA stosowany jest inny mechanizm. Najpierw usuwane jest RNA już skopiowane przez RT (reverse transcriptase – odwrotna transkryptaza) dzięki jej aktywno¶ci rybonukleazowej co powoduje pozostawienie małego odcinka jednoniciowego DNA komplementarnego do 3' końca RNA. Ten odcinek DNA jest transferowany na drug± stronę nici RNA i hybrydyzuje z 3' końcem i następnie dokończona zostaje synteza DNA(-) na matrycy RNA.

Działanie RT jako rybonukleazy prowadzi do usunięcia RNA z wyj±tkiem małego fragmentu, który zostaje użyty jako primer do syntezy pozytywnej nici DNA. Ostatecznie zostaje utworzona dsDNA z LTR (long terminal repeats) na obu końcach.

LTR zawieraj± silne promotory transkrypcji i bior± udział w procesie integracji, który może zaj¶ć w dowolnym punkcie DNA komórkowego. Wintegrowany fragment wirusa nazywany jest prowirusem i staje się stabilnym elementem genetycznym. Prowirusowe DNA jest transkrybowane przez komórkow± RNA polimerazę w RNA które zostaje opatrzone ogonem poly(A) i czapeczk± cap, a następnie może zostać upakowane w cz±steczki wirusa lub może ulec translacji w białka wirusowe.

Wiroidy s± to małe, koliste cz±steczki jednoniciowego RNA. Wiroidy s± najmniejszymi znanymi patogenami w postaci kwasu nukleinowego. Cz±steczki te atakuj± ro¶liny wyższe. Pozakomórkowo występuj± one w postaci "nagiego" RNA pozbawionego nawet kapsydu. Wiroidy nie zawieraj± genów koduj±cych białka strukturalne i s± całkowicie zależne od komórki gospodarza.

Webmaster