Transkrypcja to proces, w którym informacja zawarta w DNA - zapisana w formie sekwencji deoksyrybonukleotydów - przepisana zostaje na język rybonukleotydów w pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA) podczas reakcji katalizowanej przez enzym zwany polimeraz± II RNA.

Jak już wspomniano, każdy z etapów ekspresji jest bardzo złożony. Sama transkrypcja nie jest wyj±tkiem, dzieli się j± bowiem dalej na trzy następuj±ce po sobie zdarzenia:

• inicjację transkrypcji,
• elongację łańcucha pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA),
• terminację.

Inicjacja transkrypcji

Zanim będzie można przej¶ć do omawiania tytułowego zagadnienia, należy zapoznać się z budow± genu eukariotycznego, który jest jednostk± koduj±c± białko. Takie ujęcie znaczenia genu może być bardzo myl±ce, gdyż sugeruje ono, że cały gen ( od pierwsze go do ostatniego nukleotydu ) niesie informację o strukturze białka.

W rzeczywisto¶ci jednak takie wskazówki zawarte s± jedynie we fragmentach genu zwanych egzonami. W obrębie tej czę¶ci genu, która zostanie przepisana na mRNA oprócz egzonów występuj± również fragmenty będ±ce najczę¶ciej nic nie znacz±cymi wtrętami. Okre¶la się je mianem intronów. Jakkolwiek w czasie transkrypcji te "zbędne" fragmenty przepisywane s± tak samo jak egzony na nić pierwotnego mRNA ( pre-mRNA ), tak przed zaj¶ciem translacji s± one eliminowane.

Gen oprócz obszaru transkrybowanego zawiera jeszcze promotor i terminator odpowiednio na swoim 5' i 3' końcu, przy czym jedno i drugie należy pojmować raczej jako obszary funkcjonalne a nie jedynie strukturalne.

Schemat budowy genu eukariotycznego na przykładzie genu ssaczego i drożdżowego ( z uwzględnieniem elementów regulatorowych )

Inicjacja transkrypcji to ten moment, w którym odbywa się najbardziej precyzyjna kontrola ekspresji. To, czy dany gen w konkretnej komórce zostanie w danym momencie wyrażony, tzn. czy zostanie zsyntetyzowane okre¶lone białko, zależy w głównej mierze od tego, czy transkrypcja zostanie zapocz±tkowana. Oczywi¶cie zdarza się, że transkrypcja zachodzi, ale na dalszych etapach ekspresja zostaje wygaszona, czego skutkiem jest brak syntezy białka. Jednakże generalnie inicjacja transkrypcji jest głównym punk tem kontrolnym ekspresji.

Jako inicjację okre¶la się zdarzenia zachodz±ce w obrębie promotora, a także daleko położonych rejonów zwanych enhancerami ( wzmacniaczami ), które umożliwiaj± polimerazie II RNA podjęcie działania.W przeciwieństwie do prokariontów u polimeraza II RNA wymaga do zapocz±tkowania reakcji obecno¶ci pewnych białek, które okre¶la się mianem czynników transkrypcyjnych tzw. TF-ów ( ang. transcription factors ). Białka te w okre¶lonym porz±dku wi±ż± się do DNA w obrębie promotora, enhancerów b±dĽ silencerów.

To wła¶nie ich obecno¶ć lub brak w danej komórce ( czy tkance ) decyduje w znacznej mierze o rozpoczęciu lub też nie transkrypcji konkretnego genu. Oprócz białek na transkrypcję mog± również wpływać hormony.

Należy tu jednak zaznaczyć, że jakkolwiek TF-y s± istotne w regulacji ekspresji informacji genetycznej, tak najważniejsza jest struktura chromatyny. Wiadomo, że aby zaszła transkrypcja danego genu musi mieć do niego dostęp "aparat enzymatyczny". Je¶ li gen jest łatwo dostępny i komórka dysponuje odpowiednimi TF-ami, transkrypcja zachodzi. Jeżeli natomiast gen jest "ukryty" przed polimeraz± nic nie pomoże obecno¶ć optymalnego zestawu czynników transkrypcyjnych. To, czy dany gen jest łatwo czy trudno d ostępny zależy od tego jaka jest struktura chromatyny w rejonie, w którym występuje. Im silniejsza jest jej kondensacja tym mniejsza możliwo¶ć przył±czenia enzymu. Okazuje się, że w różnych tkankach różne rejony DNA s± mocno skondensowane ( sheterochroma tynizowane ). Tak więc, jeżeli wiadomo, że konkretny gen w danej tkance nie ulega transkrypcji z dużym prawdopodobieństwem można stwierdzić, że obszar w którym się lokuje jest niedostępny dla aparatu transkrypcyjnego.

Rejony DNA o funkcjach regulacyjnych

Sterowanie transkrypcj± - przez zwi±zanie czynników białkowych czy hormonalnych - może odbywać się z różnych miejsc na DNA. Miejsca te mog± leżeć w obrębie genów ( promotory ), lub też w odległo¶ci kilku tys. nukleotydów ( enhancery, silencery ).

Promotory

Obszar promotorowy genu znajduje się na jego 5' końcu i zawiera kilka istotnych rejonów rozpoznawanych przez polimerazę II RNA ( najbliżej miejsca startu transkrypcji ) oraz czynniki transkrypcyjne. Spo¶ród wspomnianych rejonów najistotniejszym i na jbardziej powszechnym jest kaseta TATA ( tzw. TATA-box ). Jest to 7-nukleotydowa sekwencja położona w odległo¶ci ok. 25 p.z. od miejsca startu transkrypcji, która w pełni prezentuje się następuj±co: 5'- TATAAAA -3'. Obecno¶ć kasety TATA, choć niezbędna w przypadku prawie wszystkich genów; nie jest wystarczaj±ca, aby z promotora ruszyła transkrypcja. Do pełnej aktywno¶ci promotora niezbędne s± inne sekwencje występuj±ce w rejonie od -110 do -40

( odległo¶ć podana w liczbie nukleotydów na lewo od miejsca startu transkrypcji ). Kaseta TATA stanowi tzw. czę¶ć rdzeniow± promotora. Ponadto promotory genów zawieraj± inne - nie tak powszechne - sekwencje, które odgrywaj± znacz±c± rolę w poszczególnych tkankach zaopatrzonych w białka rozpoznaj±ce owe sekwencje.

Schemat promotora genu eukariotycznego, uwzględniaj±cy rejony najbardziej powszechne )

Enhancery i silencery

Enhancery to sekwencje wzmacniaj±ce aktywno¶ć promotorów. Położone mog± być nawet w znacznej odległo¶ci od genu i zachowuj± zdolno¶ć regulacyjn± także po eksperymentalnej zmianie orientacji o 180( względem genu. Do enhancerów wi±ż± się czynniki trans krypcyjne okre¶lane jako aktywatory, które odziaływuj± z polimeraz± II RNA i TF-ami promotorowymi. Możliwo¶ć oddziaływań enhancer : promotor mimo odległo¶ci pomiędzy nimi wynosz±cej niekiedy kilka tys. p.z. istnieje dzięki dużej elastyczno¶ci nici DNA. Ow a elastyczno¶ć objawia się zdolno¶ci± DNA do dowolnego wyginania się.

Interakcje enhancer : promotor

Enhancery - rozumiane jako sekwencje -obecne s± w każdej komórce ( pamiętamy, że DNA we wszystkich komórkach organizmu jest identyczny ), natomiast tylko w niektórych wykazuj± aktywno¶ć wzmacniaj±c±. Jest to znacz±cy fakt w regulacji ekspresji info rmacji genetycznej, a bierze się on z różnic w składzie białek komórkowych poszczególnych tkanek. A zatem istniej± enhancery tkankowo-specyficzne wzmagaj±ce transkrypcję tylko tam, gdzie obecne s± białka wi±ż±ce się w ich obrębie. Enhancery maj± także is totne znaczenie w regulacji transkrypcji przez hormony steroidowe.

Silencery - ( ang. silence - cisza ), sekwencje służ±ce wyciszeniu aktywno¶ci promotora; podobnie jak enhancery mog± być w różnym stopniu oddalone od genu w obu kierunkach, a także występować w jego wnętrzu.

Ciekaw± sytuację można zaobserwować w regulacji transkrypcji genów immunoglobulin ( białek syntetyzowanych jedynie w limfocytach B ). W tym przypadku silencer wbudowany jest w obrębie enhancera, a jego znaczenie uwidocznia się w komórkach innych niż limfocyty B. Jest to swoiste zabezpieczenie przed ekspresj± genów immunoglobulin zwi±zane z inaktywacj± enhancera.

Zwi±zki steruj±ce transkrypcj±

Regulacja każdego procesu może odbywać się na dwa sposoby: pozytywny b±dĽ negatywny.

Ponieważ w przypadku transkrypcji eukariotycznej lepiej poznano regulację pozytywn± najwięcej uwagi zostanie po¶więcone aktywatorom, czyli zwi±zkom umożliwiaj±cym polimerazie II RNA rozpoczęcie syntezy nici pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA).

A. Czynniki transkrypcyjne wi±ż±ce się z promotorem.

Eukariotyczna polimeraza II RNA sama w sobie nie jest zdolna do przył±czenia się do DNA, a co za tym idzie do rozpoczęcia transkrypcji. Zanim enzym zostanie zwi±zany w rejonie startu transkrypcji, do promotora przył±czaj± się kolejno białka zaliczane do grupy TFII ( II st±d, że współpracuj± z polimeraz± II ). Kolejno¶ć przył±czania się TF-ów i polimerazy do promotora jest ¶ci¶le okre¶lona.

Tworzenie kompleksu preinicjacyjnego

Jako pierwszy do DNA wi±że się TFIID. Jest to kompleks, w którego skład wchodzi TBP oraz czynniki towarzysz±ce TBP tzw. TAF ( TBP associated factors ). TBP to białko wchodz±ce w bezpo¶redni± interakcję z DNA w obrębie TATA box. Ma ona postać siodła nasadzaj±cego się na nić kwasu nukleinowego w taki sposob, że jego krańcowe fragmenty wciskaj± się między pary zasad w DNA. Wnikanie pomiędzy zasady nici komplementarnych powoduje lekkie ( pierwotne ) rozplecenie helisy, konieczne w procesach takich jak omawiana tu transkrypcja, czy też replikacja.

fig. Model przestrzennej budowy TBP

W dalszej kolejno¶ci przył±czeniu do promotora ulega TFIIB i polimeraza II RNA ( w kompleksie z TFIIF ). TFIIF nie kontaktuje się z DNA podobnie jak TFIIE przył±czaj±cy się do powstałego kompleksu białkowego jako ostatni.

Czynniki buduj±ce wraz z polimeraz± II RNA kompleks inicjacyjny

Omówiony powyżej kompleks nosi nazwę podstawowego aparatu transkrypcyjnego i mimo tego, iż jest zdolny do przeprowadzenia transkrypcji robi to w znikomym i niewystarczaj±cym do wyraĽnej ekspresji genu stopniu. Do promotora (oprócz wymienionych TF-ów ) przył±czaj± się również białka takie jak, wspomniane wcze¶niej ssacze Sp1, NF1 oraz szereg innych.

B. Czynniki wi±ż±ce się z sekwencjami spoza promotora

Dla transkrypcji, której efektem byłaby intensywna synteza RNA ( warunek wyrażenia genu ) niezbędna jest obecno¶ć zwi±zków wzmagaj±cych transkrypcję podstawow±. S± to aktywatory transkrypcji ł±cz±ce się z DNA w rejonach enhancerowych. Kierunki oddzi aływań aktywatorów obrazuje poniższy rysunek.

Kierunki oddziaływań aktywatorów transkrypcji

Jak widać, aktywatory mog± wpływać bezpo¶rednio na białka aparatu podstawowego, b±dĽ też za po¶rednictwem koaktywatorów. Zwi±zki aktywuj±ce mog± mieć różny charakter: białkowy ( w przeważaj±cej czę¶ci ), lub też steroidowy.

Czynniki białkowe stale obecne w danej tkance s± dla niej charakterystyczne i swoje funkcje w poł±czeniu z enhancerem mog± spełniać tylko w niej.

Czynniki steroidowe, a konkretnie hormony takie jak np.glukokortykoidy pojawiaj± się w odpowiedzi na bodĽce ¶rodowiskowe i s± transportowane z miejsc syntezy do komórek docelowych. Hormon, który dociera do komórki przeznaczenia wi±że się z receptore m ( nie wszystkie komórki maj± receptory na produkowane przez organizm hormony ) i tak powstały układ - hormon : receptor - przył±cza się do enhancera reguluj±c w ten sposób transkrypcję.

Aktywowanie transkrypcji przez układ hormon : receptor

Podsumowuj±c:

1. Inicjacja transkrypcji jest momentem najbardziej precyzyjnej kontroli ekspresji genu.

2. Transkrypcja może zachodzić na różnych poziomach:

• podstawowym ( niskim ),
• zaktywowanym ( intensywnym ) w zależno¶ci od składu czynników transkrypcyjnych w danej tkance.

3. Regulacja transkrypcji zależna jest do czynników:

• wewnętrznych (struktura chromatyny w rejonie występowania okre¶lonego genu, obecno¶ć kompletu TF-ów);
• zewnętrznych - odpowiedĽ sprowokowana bodĽcami ze ¶rodowiska np. hormonalna.

Synteza nici pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA)

Po spełnieniu wszystkich warunków koniecznych do rozpoczęcia reakcji przez polimerazę II RNA, następuje synteza łańcucha pre-mRNA ( czyli prekursora mRNA) w kierunku od 5' do 3' końca. Trankrypcja jednego fragmentu katalizowana jest przez jedn± cz±s teczkę enzymu.

Budowa polimerazy II RNA

Eukariotyczne polimerazy II RNA składaj± się z 8 (12 podjednostek ( tzn. różnych polipeptydów ), s± więc enzymami wysoce złożonymi. Wspóln± ich cech± jest obecno¶ć podjednostek RPB1, 2, 5, 6, 8, z których pierwsze dwie s± dużymi białkami o masach cz±steczkowych odpowiednio 220 i 140 kDa. Na C-końcu ( końcu karboksylowym białka ) podjednostki RPB 1 występuje w zmiennej ( w zależno¶ci od organizmu ) liczbie powtórzeń sekwencja 7-aminokwasowa, która okazuje się być niezbędna do działania enzymu. Jak do tej pory nie okre¶lono funkcji poszczególnych podjednostek enzymu eukariotycznego w odróżnieniu od enzymu prokariotycznego, w którym zdefiniowano rolę każdej z podjednostek.

Polimeraza II RNA zlokalizowana jest w nukleoplazmie i oprócz syntezy mRNA przeprowadza tam również syntezę snRNA ( ang. small nuclear RNA ) tj. cz±steczek, o których mowa będzie przy okazji splicingu.

Jak działa polimeraza II RNA?

Jak wiadomo zadaniem polimerazy II RNA jest przepisywanie informacji zawartej w genie ( DNA ) na język RNA. Informacja ta ( dotycz±ca struktury białek ) zapisana jest tylko w jednej nici DNA, w tzw. nici koduj±cej. Druga nić - komplementarna - nie niesie informacji o białku, a stanowi matrycę dla polimerazy, która syntetyzuje pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA) na zasadzie komplementarno¶ci. Zasada ta polega na wbudowywaniu do powstaj±cej nici informacyjnego RNA nukleotydu adeninowego (A) je¶li w odczytywanym miejscu na mat rycy obecny jest nukleotyd tyminowy (T), guaninowego (G) je¶li na matrycy jest cytozynowy (C) itd.(Tabela)

A zatem transkrypt jest komplementarny do nici matrycowej i homologiczny z nici± koduj±c±.

Należy jednak pamiętać, że jakkolwiek homologami G, C i A w pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA) s± rybonukleotydy nios±ce te same zasady azotowe, to homologiem T jest rybonukleotyd zawieraj±cy uracyl (U) a nie tyminę.

Porównanie sekwencji pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA) z sekwencjami nici koduj±cej i matrycowej genu.
( kolorem czerwonym oznaczono nić koduj±c±, a zielonym nić matrycow± )

5'- A A T C G G C A T G C C A T G G C C T T G C G C T A - 3' Gen

3'- T T A G C C G T A C G G T A C C G G A A C G C G A T - 5'

5'- A A U C G G C A U G C C A U G G C C U U G C G C U A - 3' pre-mRNA

Zgodnie z tym co zostało powiedziane, enzym syntetyzuj±cy pre-mRNA sun±c po DNA dobiera odpowiednie rybonukleotydy i przył±cza je kolejno w kierunku 5'- 3'( tzn. do wolnej grupy 3'OH pierwszego nukleotydu przył±czona zostaje 5' grupa fosforanowa kol ejnego nukleotydu ). Kierunek ten obowi±zuje w każdej reakcji polimeryzacji kwasów nukleinowych i wynika z mechanizmu tworzenia wi±zań między s±siaduj±cymi ze sob± nukleotydami - wi±zań fosfodiestrowych. ( Patrz. Chemiczne podstawy biologii molekularnej. ) Polimeraza RNA jest enzymem wprowadzaj±cym więcej pomyłek od polimerazy DNA ponieważ nie wykazuje wła¶ciwo¶ci korekcyjnych, st±d przepisanie informacji z DNA na RNA nie jest tak wierne jak z DNA na DNA w procesie replikacji. Brak systemów korekcyjnych w transkrypcji nie niesie ze sob± dla komórki poważnych konsekwencji, gdyż nieprawidłowa cz±steczka mRNA jest jedn± w¶ród wielu prawidłowych.

Synteza łańcucha pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA) zaczyna się zwykle od zwi±zania przez enzym nukleotydu guaninowego lub adeninowego, do których przył±czane s± kolejne ,, cegiełki''.

Struktura kapów

Bardzo charakterystycznym dla eukariontów zjawiskiem jest tworzenie w pierwotnym transkrypcie struktury czapeczki ( ang. cap ) wpływaj±cej na podniesienie stabilno¶ci pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA). Proces ten zachodzi równolegle z transkrypcj± i jest jednym z etap ów obróbki pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA)( inne rodzaje obróbki zachodz± po zsyntetyzowaniu całej nici pierwotnego mRNA i zostan± omówione osobno ). Transkrypt uposażony w czapeczkę jest mniej wrażliwy na działanie nukleaz i fosfataz tj. enzymów odpowiedzialnych za degradację kwasu nukleinowego. Rozpoznanie cap jest także istotne w inicjacji translacji. Mechanizm tworzenia czapeczki obejmuje 3 zasadnicze etapy: - modyfikację trifosforanu 5' końca ( patrz. "Struktura białek i kwasów nukleinowych" ) przez uwolnienie jednej z reszt fosforanowych na drodze hydrolizy; - przył±czenie GTP wi±zaniem 5'-5'- trifosforanowym; - metylacja guaniny w pozycji N7 tj. przył±czenie reszty metylowej (-CH3 ) do atomu azotu 7-go w cz±steczce guaniny w wyniku reakcji: reakcja metylacja reszt cukrowcowych (rybozy) kolejnych nukleotydów może wygenerować kolejne czapeczki (1, 2).

Wydłużanie łańcucha pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA) kończy się w miejscach terminacji, które dosyć dokładnie poznane s± u Procaryota, natomiast nadal słabo scharakteryzowane u organizmów wyższych.

Podsumowanie:

1. Transkrypcj± rz±dzi zasada komplementarno¶ci.

2. Wydłużanie nici pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA) zachodzi w kierunku 5'-> 3'.

3. Równolegle z elongacj± pierwotnego transkryptu zachodzi modyfikacja jego 5' końca tj. tworzenie struktury czapeczki.

4. Produktem reakcji katalizowanej przez polimerazę II RNA jest pre-mRNA tzn. cz±steczka zawieraj±ca introny.

EKSPRESJA INFORMACJI GENETYCZNEJ

OBRÓBKA PRE-mRNA

Webmaster