BIBLIOTEKI A MOŻE BANKI DNA I CO SIĘ W NICH PRZECHOWUJE.

BIBLIOTEKI A MOŻE BANKI DNA I CO SIĘ W NICH PRZECHOWUJE.

BANK (inaczej BIBLIOTEKA) DNA - to zespól fragmentów DNA danego organizmu poł±czonych z cz±steczkami wektorów. Bibliotekę poddać można screeningowi czyli przeszukaniu przy pomocy różnych metod w zależno¶ci od tego czym dysponujemy i czego szukamy.

Dobrze skonstruowany bank genów to taki , w którym każda sekwencja genomowego DNA ma swoj± reprezentację w postaci klonu. W przypadku gdy przy konstrukcji banku DNA miało szansę na losowe pęknięcie , tak jak się to dzieje np. przy fragmentacji mechanicznej , do oceny reprezentatywno¶ci bibioteki stosuje się wzór :

N=ln(1-P)/ln[1-(I/G)]

gdzie :

N - ilo¶ć niezależnych klonów

P - prawdopodobieństwo obecno¶ci danej sekwencji w banku (przyjmuje się 99%)

I - wielko¶ć ¶redniego insertu (wstawki) w wektorze wyrażona w parach zasad

G - wielko¶ć genomu w parach zasad

Ponieważ preparat DNA pochodzi z bardzo wielu komórek , każdy rodzaj fragmentu zdarza się w nim wielokrotnie. Wektory ł±cz± się z fragmentami do¶ć przypadkowo. Przy tworzeniu biblioteki trzeba wykorzystać duż± wielokrotno¶ć liczby klonów , które powinny być w niej reprezentowane. Mimo wszystko nie otrzymamy nigdy 100% pewno¶ci , że każda sekwencja jest w banku obecna. Obliczono , że aby uzyskać 99% prawdopodobieństwo reprezentacji wszystkich klonów w banku potrzeba wyj¶ciowej liczby około 5 000 klonów na wektorach plazmidowych w komórkach E.coli dla drożdży i 800 000 klonów w przypadku człowieka.

Wyróżniamy dwa rodzaje bibliotek DNA :

BIBLIOTEKI GENOMOWE - fragmentacji poddawany jest cały DNA danego organizmu , ł±czy się go z cz±steczkami wektora. Po transformacji komórek gospodarza banku w każdej z nich znajdzie się jeden wektor. Potomstwo komórki wyj¶ciowej będzie zawierało ten sam fragment czyli zostanie on namnożony inaczej sklonowany. Bibioteka taka jest reprezentacj± całego DNA organizmu zarówno koduj±cego (geny , egzony genów) jak i niekoduj±cego (introny , sekwencje regulatorowe , repetytywne , ruchome i inne o nie znanym znaczeniu). Ma to swoje zalety i wady. Je¶li dobrze przygotujemy tak± bibiotekę mamy bardzo duże szanse na znalezienie interesuj±cego nas genu. Często zdarza się tak , że na żadnym z klonów nie znajdziemy cało¶ci genu. Dzieje się tak ponieważ jest duża szansa na to , że enzym użyty do konstrukcji banku może mieć miejsce cięcia w obrębie interesuj±cej nas sekwencji. Szansa ta ro¶nie wprost proporcjonalnie do jej długo¶ci. Aby obej¶ć ten problem można tak dobrać warunki trawienia by enzym nie trawił we wszystkich możliwych miejscach co zwiększa szansę na znalezienie cało¶ci genu. W przypadku gdy szukanym przez nas odcinkiem DNA jest nie gen ale np. promotor , enhancer czy inna sekwencja regulacyjna bibioteka genomowa jest niezast±piona.

BIBLIOTEKI cDNA - z komórek izoluje się mRNA a następnie przy użyciu odwrotnej transkryptazy przepisuje się mRNA na DNA tworz±c cDNA (complementary DNA - komplementarny do mRNA).

Odwrotna transkryptaza - enzym izolowany z retrowirusów , katalizuje reakcję polimeryzacji dNTP w komplementarny łańcuch DNA używaj±c cz±steczki mRNA jako matrycy. Dodane wolne oligo dT hybrydyzuj± z 3` końcem łańcucha mRNA (poli-A) i służ± jako starter. Następnie mRNA jest usuwane przez podwyższenie pH (pH alkaliczne) , co powoduje hydrolizę RNA ale nie DNA. Jednoniciowy DNA (ssDNA) jest wydłużany na 3` końcu dzięki terminalnej transferazie , która przenosi pojedyncze nukleotydy dG nie wymagaj±c matrycy. Chemicznie zsyntetyzowany starter oligo-dC hybrydyzuje do 3` oligo-dG. Następuje synteza komplemetarnego łańcucha. Powstaje dwuniciowy DNA (dsDNA). Ligowane s± krótkie (10-12 bp) kawałki dsDNA , zawieraj±ce miejsce rozpoznawane przez konkretny enzym restrykcyjny tzw. linkery. DNA cięte jest t± restryktaz± (cDNA jest modyfikowane , przed przył±czeniem linkerów , odpowiednim enzymem , który metyluje specyficzne dla danej restryktazy sekwencje , aby zapobiec cięciu w obrębie cDNA). Wynikiem tych wszystkich zabiegów jest dwuniciowy cDNA z lepkimi końcami z obu stron. Potem postępuje się podobnie jak poprzednio czyli ł±czy cDNA z cz±steczkami wektora przeciętego t± sam± restryktaz± i wprowadza do komórek gospodarza banku gdzie ulegn± namnożeniu.

Wady : należy pamiętać , że w ten sposób uzyskujemy bibliotekę tylko tych genów , które s± w danym momencie i w danej tkance aktywne transkrypcyjnie , dlatego należy dobrze przemy¶leć wybór tkanki i czas izolacji. Takiego problemu nie ma gdy poszukiwany gen jest genem podstawowym i we wszystkich tkankach ulega ekspresji. Inn± wad± jest reprezentacja w różnych ilo¶ciach kopii różnych odcinków cDNA ponieważ nie we wszystkich komórkach transkrypty danego genu będ± występowały tak samo licznie.

Zalet± takiego banku jest pewno¶ć , że każda cz±steczka cDNA zawiera informację genetyczn± odpowiadaj±c± dokładnie jednemu genowi czyli każdy klon to jeden cały gen. Inn± korzy¶ci± jest fakt braku intronów co można wykorzystać kiedy chcemy produkować dane białko w komórkach bakterii , która normalnie nie przeprowadza splicingu.

BIOTECHNOLOGIA , INŻYNIERIA GENETYCZNA - CO TO TAKIEGO ?

ENZYMY , KTÓRE TNˇ DNA NA FRAGMENTY...