WEKTOR - cz±steczka DNA mog±ca być no¶nikiem interesuj±cego nas kawałka DNA , która posiada zdolno¶ć do autonomicznej replikacji w danym typie komórek. Zapewnia powielanie wprowadzonego fragmentu DNA czyli klonowanie a czasami także wydajn± synt ezę kodowanego przez gen białka (transkrypcję i translację oraz jego stabilno¶ć) jak to ma miejsce w tzw. wektorach ekspresyjnych. S± różne typy wektorów a dobranie odpowiedniego zależy m.in. od tego w jakich komórkach zamierzamy klonować gen. Najważniejszym elementem warunkuj±cym specyficzno¶ć wektora s± sekwencje odpowiedzialne za inicjację replikacji tzw. sekwencje ori. Najprostsze wektory posiadały wył±cznie jedno , unikalne miejsce restrykcyjne , w które można było wprowa dzić obcy DNA. Obecnie najczę¶ciej jest to tzw. polilinker - syntetyczny odcinek DNA , w którym znajduje się zwykle kilkana¶cie miejsc rozpoznawanych przez różne restryktazy.
Pozwala to na swobodniejszy dobór odpowiedniego do klonowania enzymu. Wektory zazwyczaj posiadaj± również geny markerowe czyli geny koduj±ce białka odpowiedzialne za łatwo wyróżnialne cechy fenotypowe. Wektor mus i być tak skonstruowany aby istniała możliwo¶ć selekcji tych komórek , do których wnikn±ł. Jego budowa powinna pozwalać także na odróżnienie wektora zrekombinowanego od takiego , który zamkn±ł się bez ligacji z fragmentem DNA.

Budowa - nieduże , koliste cz±steczki DNA zawieraj±ce ori replikacji , gen markera selekcyjnego (najczę¶ciej oporno¶ć na antybiotyk) oraz miejsce do klonowania.

Wektory plazmidowe wprowadzane s± do komórek bakterii przy wykorzystaniu zjawiska transformacji. W przypadku stosowanej najczę¶ciej bakterii - E.coli wymaga to zwiększenia przepuszczalno¶ci błon komórkowych czyli ukompetentnienia. W tym c elu wystawia się komórki na wysok± koncentrację pewnych dwuwarto¶ciowych kationów. W typowej procedurze komórki traktuje się roztworem chlorku wapnia. Zazwyczaj 1 komórka na milion zostaje stransformowana. 1 cz±steczka na tysi±c zrekombinowanych plazmidów transformuje komórkę bakteryjn±. Każda kompetentna komórka inkorporuje tylko jeden plazmid. Selekcję zazwyczaj uzyskuje się na dwa sposoby. Pierwszy z nich to obecno¶ć w plazmidzie dwóch genów oporno¶ci na dwa różne antybiotyki przy czym w j ednym z nich znajduje się miejsce do klonowania. Komórka , która nie pobrała plazmidu będzie wrażliwa na obydwa antybiotyki , taka , która pobrała plazmid niezrekombinowany będzie oporna na obydwa. Komórka , która ma plazmid z fragmentem obcego DNA będzie wrażliwa na antybiotyk , w którego genie było miejsce restrykcyjne , ponieważ ci±gło¶ć genu zostanie przerwana co unieczynni produkowane białko. Drugi sposób to system selekcji opieraj±cy się na tzw. te¶cie alfa-komplementacji. Polilinkery większo¶ci wek torów umiejscowione s± w obrębie genu koduj±cego a peptyd b-galaktozydazy. Transformowane s± bakterie , które maj± mutację akurat we fragmencie genu koduj±cym t± czę¶ć enzymu. Umożliwia to selekcję na odpowiedniej pożywce bakterii , które pobrały zrekombi nowany plazmid ponieważ tylko one będ± białe w odróżnieniu od tych , w których zaszła komplementacja mutacji i sprawny enzym rozkłada substrat dodany w pożywce co powoduje niebieskie zabarwienie kolonii.

Pojedyncze komórki bakteryjne , utworz± kolonie a wszystkie plazmidy w takiej kolonii będ± pochodziły od jednego plazmidu wprowadzonego do komórki , która t± kolonię założyła. Powstanie więc klon a fragment DNA na plazmidzie to sklonowany DNA.

Pojemno¶ć wektorów plazmidowych ograniczona jest sposobem wprowadzania rekombinacyjnych cz±stek DNA do komórek gospodarza. Przy klasycznej transformacji wielko¶ć wstawki nie powinna być większa niż około 10 kb.

Warto zwrócić jeszcze uwagę na ilo¶ć kopii wektora w komórce. Istniej± wektory niskokopijne i wysokokopijne co uzależnione jest od rodzaju ori.

Klonowanie w wektorze plazmidowym polega na przecięciu go stosownym enzymem restrykcyjnym , defosforylacji jego końców w celu wyeliminowania możliwo¶ci recyrkularyzacji samego wektora oraz ligacji , któr± to reakcję przeprowadza ligaza DNA tworz ±ca standardowe wi±zanie fosfodiestrowe , z odpowiednio wcze¶niej przygotowanymi fragmentami DNA , które chcemy sklonować , pociętymi t± sam± restryktaz± lub daj±c± komplementarne końce.

LAMBDOWE - pochodne faga l.

Można w nich klonować większe fragmenty DNA. Inn± zalet± jest wyższa wydajno¶ć infekcji cz±stkami bakteriofagów w porównaniu do wydajno¶ci transformacji.Budowa : odpowiednio zmodyfikowany bakt eriofag l. Wprowadzono mutacje punktowe w niektórych genach zmieniaj±ce wła¶ciwo¶ci ich produktów : krótkie delecje oraz niekiedy usunięcie ¶rodkowego regionu DNA odpowiedzialnego za cykl lizogenny. Z DNA faga można usun±ć około 30% genomu pozostawiaj±c j ego lewe i prawe ramię zawieraj±ce wszystkie geny niezbędne w cyklu litycznym. Dzięki 12 nukleotydowym , wzajemnie komplementarnym , jednoniciowym fragmentom DNA na końcach cz±steczki DNA faga - tzw. sekwencjom cos - możliwe jest przybranie przez D NA faga w komórce bakteryjnej formy kolistej oraz zapakowanie go w białkow± główkę. Również w te wektory wstawione s± polilinkery , geny markerowe , silne promotory i inne.

S± dwa rodzaje wektorów lambdowych , co spowodowane jest faktem , że do białkowej główki pakowane jest DNA długo¶ci 75% do 105% długo¶ci DNA faga typu dzikiego :

• replacement - tak skonstruowane , że centralny region jest oflankowany identycznym zestawem miejsc restrykcyjnych tak , że przecięcie dan± restryktaz± wycina ten region z wektora. Na jego miejsce może być wstawiony obcy DNA długo¶ci 9-25 kb. Klonow anie polega na izolacji poszczególnych ramion po wycięciu regionu centralnego i ligacji ze zdefosforylowanymi fragmentami obcego DNA (co uniemożliwia wstawienie dwóch różnych odcinków DNA do jednego wektora) w warunkach sprzyjaj±cych tworzeniu konkata merów , następnie pakowaniu in vitro w kapsydy faga i infekcji komórek E.coli.

• insercyjne - zawieraj±ce drobne modyfikacje dzikiego genomu faga. Odcinek obcego DNA musi zawierać się w granicach od 0 do 8 kb. Klonowanie polega na przecięciu odpowiednim enzymem restrykcyjnym w miejscu do klonowania , izolacji poszczególnych ramion i ligacji z fragmentami DNA w warunkach umożliwiaj±cych tworzenie konkatamerów , pakowaniu w kapsydy faga i infekcji E.coli.

Wprowadzanie do komórek gospodarza odbywa się z wysok± efektywno¶ci± - z reguły 1 na 20 cz±steczek zrekombinowanego wektora jest efektywnie pakowana w kapsyd i wprowadzana do komórek E.coli na drodze transfekcji.

POCHODNE FAGA M13 - szczególny cykl życiowy tego faga pozwala na wykorzystanie go do wytwarzania jednoniciowego DNA czyli kiedy chodzi np. o sekwencjonowanie DNA lub ukierunkowan± mutagenezę.

KOSMIDOWE - stosowane do klonowania dużych fragmentów DNA np. operonów prokariotycznych czy genów eukariotycznych. Budowa : s± to zmodyfikowane plazmidy zawieraj±ce sekwencję cos faga l konieczn± przy pakowaniu DNA do kapsydów fago wych. Najprostsze kosmidy zawieraj± ori repilkacji , gen markera selekcyjnego , miejsce do klonowania oraz sekwencję cos. Modyfikacje tego typu wektorów polegaj± na zwiększaniu ilo¶ci miejsc do klonowania (polilinkery) , wprowadzaniu element ów umożliwiaj±cych analizę klonowanego DNA np. promotorów fagów T3 , T7 itp. , wprowadzeniu elementów umożliwiaj±cych propagację wektora w komórkach eukariotycznych tj. ori eukariotyczne , gen markera selekcyjnego dla komórek eukariotycznych oraz w prowadzeniu drugiej sekwencji cos.

Wprowadzanie rekombinowanych cz±steczek wektora jest podobne do infekcji fagowej. DNA wektora zligowanego z odpowiedniej wielko¶ci fragmentami obcego DNA jest in vitro pakowany w kapsydy faga a następnie wprowadzany do komórek gospodarza na drodze transdukcji. Tam kosmidy zachowuj± się jak plazmidy. Pojemno¶ć takiego wektora jest ograniczona obustronnie. Klonowany DNA musi być wielko¶ci od 35 do 45 kb ponieważ do kapsydu może zostać wprowadzo ny DNA nie mniejszy niż 38 kb i nie większy niż 52 kb. Tak więc proces pakowania wymaga powstania układu dwóch sekwencji cos na jednej cz±steczce DNA oddalonych od siebie o 38 do 52 kb. Osi±ga się to albo tn±c wektor odpowiedni± restryktaz± i defos forylowany liguj±c z odpowiedniej wielko¶ci fragmentami obcego DNA przy wysokim stężeniu DNA i nadmiarze wektora (9:1) co sprzyja powstawaniu konkatamerów albo gdy wektor zawiera dwie sekwencje cos , rozcina się go w dwóch miejscach : w miejscu do klonowania i między sekwencjami cos , następnie liguje się go ze zdefosforylowanymi fragmentami obcego DNA przy wysokim stężeniu ATP co powoduje , że ł±czenie tępych końców jest bardzo mało wydajne a więc głównym produktem reakcji jest obcy DNA poł ±czony z fragmentami wektora.

WEKTORY DROŻDŻOWE. Drożdże jako komórki gospodarzy posiadaj± niezaprzeczalne zalety : maj± struktury komórkowe typowe dla eukariota , geny w nich klonowane mog± zawierać sekwencje intronowe , proces obróbki mRNA jest zbliżony do tego , który wys tępuje u wyższych eukariontów , białka podlegaj± modyfikacjom posttranslacyjnym. Wynika z tego , że klonować DNA w drożdżach należy wtedy gdy zależy nam na uzyskaniu ekspresji badanego genu w komórce eukariotycznej i odpowiednio zmodyfikowanych białkowych produktów. Występuj± dwa typy tych wektorów : replikatywne - gdy ori pochodzi z chromosomów drożdży (tzw. sekwencja ars) lub episomalne - gdy ori pochodzi z naturalnie występuj±cego u drożdży plazmidu 2 m.

Poza tym wektory te posiadaj± geny markerowe oraz polilinkery.

Mog± to być wektory bifunkcjonalne (wahadłowe) czyli maj±ce odrębne miejsca startu replikacji i geny markerowe dla komórek drożdżowych jak i bakteryjnych np. E.coli co umożliwia m.in. klonowanie genów w komórkach bakteryjnych a badanie ich ekspr esji w drożdżach.

Skonstruowano również sztuczne chromosomy drożdżowe czyli YAC. Istnieje możliwo¶ć klonowania w nich bardzo dużych fragmentów DNA do 500 kb. YAC posiada sekwencje , które umożliwiaj± replikację naturalnych chromosomów czyli ars oraz zapewniaj± se gregację podczas podziału - sekwencje telomerowe i centromerowe , ponadto znajduj± się tam geny markerowe i polilinkery.

INNE WEKTORY.

WEKTORY POCHODNE WIRUSA SV40 (Simian Virus) - zbudowane z 500 bp fragmentu DNA wirusa zawieraj±cego ori , promotory genów koduj±cych wczesne białka wirusa a także sekwencje regulacyjne odpowiedzialne za aktywację transkrypcji z tych prom otorów przez komórkowe czynniki transkrypcyjne. Używany do klonowania w komórkach ssaczych.

WEKTORY POCHODNE RETROWIRUSÓW - stosuje się je w tzw. bezpiecznych układach złożonych. Pierwszy składnik to dwuniciowe DNA z sekwencjami LTR (long terminal repeats - długie końcowe powtórzenia) , pełni±cymi funkcję promotorów genów wirusa i niezbęd ne do integracji DNA wirusa z chromosomem gospodarza oraz z sekwencji psi warunkuj±cej pakowanie kwasu nukleinowego do kapsydu. Drugi składnik to linia komórek z prowirusem pozbawionym sekwencji psi a posiadaj±cym geny koduj±ce białka otoczk i wirusa i odwrotn± transkryptazę. Klonowanie w komórkach ssaczych przeprowadza się w ten sposób , że DNA retrowirusa z wł±czonym do niego obcym genem wprowadza się do specjalnej linii komórkowej , w której produkt jego transkrypcji pakowany jest w otoczk i białkowe , izoluje się je i infekuje nimi komórki docelowe. Tu następuje przepisanie z RNA na DNA , który wł±czany jest do chromosomu co daje pocz±tek transformowanej linii komórkowej.

WEKTORY POCHODNE BAKULOWIRUSÓW - wektor skonstruowany został z sekwencji bakteryjnych ori i genu oporno¶ci na antybiotyk a także kasety ekspresyjnej , w skład której w chodzi polilinker i sekwencje regulacyjne genu polihedryny bakulowirus a czyli promotor i terminator. Komórki owadów lub całe larwy transfekuje się mieszanin± DNA bakulowirusa i zlinearyzowanego wektora nios±cego zrekombinowany gen i gen markerowy umożliwiaj±cy selekcję w komórkach owadów. Wewn±trz komórki dochodzi do homolo gicznej rekombinacji i utworzenia zrekombinowanego wirusa , który zamiast genu polihedryny ma gen , który chcemy sklonować. Dochodzi tu do prawidłowych modyfikacji posttranslacyjnych klonowanych białek. Wydajno¶ć produkcji jest do¶ć niska a koszt stosunko wo wysoki. Znajduj± one zastosowanie przy produkcji odczynników analitycznych , diagnostycznych i niektórych leków.

WEKTORY POCHODNE ADENOWIRUSÓW - w cyklu rozwojowym wprowadzaj± wiele kopii DNA do komórki. Informacja genetyczna ulega ekspresji ale nie ulega replikacji ponieważ znajduje się poza DNA gospodarza. W kolejnych pokoleniach komórek wprowadzonego DN A jest coraz mniej. Wprowadzane odcinki DNA nie mog± być zbyt długie. Stosowany do klonowania w komórkach ssaczych.

Zawieraj± odpowiednio usytuowany silny promotor umożliwiaj±cy ekspresję na wysokim poziomie białka , którego gen znajduje się na tym wektorze.

1. Plazmidowe wektory ekspresyjne zawieraj±ce silne , regulowane promotory. Taki silny , regulowany promotor powoduje , że w specyficznych warunkach transkrypcja jest inicjowana wiele razy na minutę. Przykładem może być promotor laktozowy. Transkrypcję wzmaga się przez dodanie do pożywki IPTG (analog laktozy).

2. Plazmidowe wektory ekspresyjne zawieraj±ce promotor póĽnych białek faga T7. Promotor genu RNA polimerazy faga T7 to specyficzna sekwencja 23 bp. System ten jest do¶ć skomplikowany. Składa się z dwóch elementów. W zrekombinowanych komórkach E.coli , zawieraj±cych gen koduj±cy T7 RNA polimerazę wstawiony za promotorem laktozowym zachodzi synteza dużej ilo¶ci RNA polimerazy gdy do pożywki dodane jest IPTG. Komórki te s± transformowane wektorem plazmidowym , który niesie kopię promotora T7 i cDNA genu koduj±cego wybrane białko. RNA polimeraza wi±że się z promotorem T7 na wektorze plazmidowym co katalizuje transkrypcję wstawionego cDNA.

3. Istniej± także eukariotyczne systemy ekspresyjne. Jest to szczególnie istotne gdy chcemy otrzymać aktywne białko , w którym prawidłowo zostały przeprowadzone modyfikacje posttranslacyjne.

ENZYMY , KTÓRE TNˇ DNA NA FRAGMENTY I ŁˇCZˇ JE POZWALAJˇC NA NIEZLICZONˇ ILO¦Ć KOMBINACJI TYCHŻE.

SCREENING BANKU GENÓW CZYLI IDENTYFIKACJA ODPOWIEDNIEGO KLONU. SZUKANIE IGŁY W STOGU SIANA ?

Webmaster