![]() |
SCREENING BANKU GENÓW CZYLI IDENTYFIKACJA ODPOWIEDNIEGO KLONU. SZUKANIE IGŁY W STOGU SIANA ? Gdy zależy nam na wyodrębnieniu pojedynczego , konkretnego genu jakiegoś organizmu to po utworzeniu banku genów tego organizmu i stransformowaniu nim odpowiednich komórek gospodarza należy zidentyfkować klon komórek , w którym znajduje się gen. Przeszukiwanie jest zazwyczaj bardzo pracochłonne. Testowanie polega na wysiewaniu na szalki komórek gospodarza np. bakterii z plazmidami badź fagami w takim stężeniu aby możliwe było odróżnienie poszczególnych kolonii lub łysinek. Liczba tych szalek jest w najlepszym przypadku rzędu kilkaset a dochodzi nawet do kilku tysięcy. Wybór metody screeningu jest uzależniony od szeregu czynników 1. METODY HYBRYDYZACYJNE - stosuje się w przypadku dysponowania sondą molekularną DNową lub RNową homologiczną do poszukiwanej sekwencji w różnym stopniu - niekoniecznie w 100%. Nie jest w tym przypadku wymagana ekspresja sklonowanego genu w komórkach gospodarza. Hybrydyzacja - powstawanie stabilnych struktur dwuniciowych z cząsteczek o komplementarnych sekwencjach nukleotydów. Pojawiają się one już nawet wtedy gdy istnieją kilkunastonukleotydowe odcinki o komplementarnym układzie zasad. Kompleks taki charakteryzuje się specyficzną temperaturą przejścia powyżej której ulega dysocjacji. Specyficzność hybrydyzacji zależy od sekwencji i składu nukleotydów , siły jonowej stosowanych buforów oraz temperatury. Operując tymi parametrami możemy uzyskiwać hybrydyzację cząsteczek , których homologia nie przekracza 50%. Sondą molekularną może być odcinek DNA lub RNA homologiczny do fragmentu , który chcemy odnaleźć. Niekoniecznie w pełni komplementarny do poszukiwanej sekwencji. Wtedy także zachodzi hybrydyzacja jednak z mniejszą wydajnością a utworzony kompleks jest mniej trwały. Sonda musi być wyznakowana (radioaktywnie lub nieradioaktywnie) czyli związana ze znacznikiem , który umożliwi jej uwidocznienie a zarazem zlokalizowanie zhybrydyzowanej z nią sekwencji. Sondy :
Sondy znakować można :
Metody hybrydyzacyjne to :
![]() 2. METODY IMMUNOLOGICZNE - mogą być stosowane do detekcji każdego białka jeśli tylko możemy uzyskać przeciwciała. Należy jednak pamiętać , że przeciwciała wiążą się jedynie z niewielkimi fragmentami białka - epitopami , które mają charakter przestrzenny. Wymagana jest zatem właściwa konformacja białka przy reakcji. Warunkiem użycia tego typu metod jest ekspresja poszukiwanych genów w komórkach gospodarza banku. Szczególnie skuteczne w przypadku bibliotek cDNA. Umożliwia znalezienie genu w przypadku gdy dysponujemy oczyszczonym białkiem a szukamy genu je kodującego. Metody immunologiczne to :
3. METODY SELEKCJI BEZPOŚREDNIEJ - stosowane w przypadku gdy znany jest bezpośredni efekt fenotypowy klonowanego genu - gdy jego ekspresja powoduje zmiany morfologiczne lub fizjologiczne transformowanych komórek. Założeniem tego typu screeningu jest ekspresja klonowanych genów w komórkach gospodarza. Przykłady : - Poszukujemy genu kodującego b galaktozydazę , po transformacji komórek E.coli bankiem genów i wysianiu ich na podłoże z X-gal - związek , który spowoduje niebieskie zabarwienie kolonii wytwarzających ten enzym. Ponieważ do transformacji używamy komórek nie wytwarzających tego enzymu to jedynie te klony komórek , do których trafił wektor z poszukiwanym genem staną się niebieskie. - Komplementacja mutacji : poszukujemy gen kodujący jeden z enzymów na szlaku biosytnezy argininy u drożdży , transformujemy szczep drożdży arg_ i wysiewamy na pożywkę bez argininy. W tym przypadku wyrosną tylko te komórki , w których będzie eksprymowany gen kodujący odpowiedni enzym z tego szlaku. - Poszukujemy genu kodującego hemolizynę , bank genów wysiewamy na podłoże z krwią. Klon zawierający poszukiwany gen ujawni fenotypowy efekt hemolizy erytrocytów wokół kolonii.
REKOMBINOWANE DNA W MEDYCYNIE , PRZEMYŚLE I FARMACJI. WSPANIAŁA WIZJA PRZYSZŁOŚCI ?
![]() Š 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie Webmaster ![]() |