
TECHNIKA SOUTHERN
(DNA-DNA) - hybrydyzacja DNA w celu identyfikacji określonego fragmentu DNA.
Etapy : 1. Izolacja i oczyszczanie DNA z komórek lub tkanek.
Jeżeli musimy wyizolować DNA z tkanki lub organizmu pierwszym etapem będzie
homogenizacja czyli roztarcie na jednolitą masę. Nie jest to konieczne gdy materiałem są
komórki w roztworze np. bakterie w pożywce czy krew. Następne etapy są na ogół dość
podobne. Obejmują cykl dodawania różnych roztworów (np. lizozymu - enzymu niszczącego
ściany komórkowe w przypadku bakterii , detergentów destabilizujących błony komórkowe
itp.) , wielokrotnego wirowania a także jeśli zachodzi potrzeba podczyszczania preparatu z
białek (np. denaturacja przy użyciu fenolu) i RNA (np. wytrącanie octanem amonu i
trawienie RNazą). 2. Trawienie DNA odpowiednimi restryktazami. .gif) 3. Rozdział elektroforetyczny fragmentów DNA według wielkości i ich denaturacja in situ.
Po rozdziale na żelu DNA zostaje zdenaturowany pod wpływem NaOH a następnie poddaje
się go działaniu roztworu neutralizującego o pH 7,4.
4. Przeniesienie fragmentów DNA z żelu na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy z zachowaniem
ich charakterystycznego rozmieszczenia. Umożliwia to siła ssąca bibuły przy transferze
kapilarnym. Możliwy jest także elektrotransfer. Następnie DNA zostaje związany z filtrem
przez zapiekanie w 80°C lub przez naświetlanie UV. 5. Hybrydyzacja z sondą.
a. Prehybrydyzacja - polega na moczeniu filtru w odpowiednim roztworze , którego składniki
blokują miejsca mogące związać kwasy nukleinowe na filtrze. Nylon i nitroceluloza ,
z których produkuje się filtry mają wysokie powinowactwo do jednoniciowego DNA czy
RNA. Po przeniesieniu badanego materiału jest to już cecha niekorzystna. W celu
zminimalizowania tła wynikającego z hybrydyzacji sondy do losowych cząsteczek DNA
lub RNA dodaje się również niehomologiczne DNA nośnikowe. Od tego etapu
uzależniona jest czułość i specyficzność eksperymentu. Eliminuje niespecyficzne tło.
Warunki prehybrydyzacji - stężenie soli , temperatura - są takie same jak właściwej
hybrydyzacji.
b. Właściwa hybrydyzacja - w tym właśnie etapie wyznakowana sonda wiąże się z
unieruchomionymi na filtrze kwasami nukleinowymi. Dobranie odpowiednich warunków
zapewnia specyficzność czyli wiązanie sondy tylko z określonymi fragmentami oraz
czułość. W przypadku gdy mamy 100% lub dość wysoką homologię stosujemy ostrzejsze
warunki : wyższą temperaturę (65°C) , mniejsze stężenie soli , czasami dodatek
formamidu. Gdy homologia jest częściowa , wymagane są mniej ostre warunki : niższa
temperatura (55°C) , wyższe stężenie soli. Sondę przed dodaniem należy zawsze
zdenaturować w wysokiej temperaturze ponieważ musi być ona w postaci jednoniciowej ,
co umożliwi jej związanie na filtrze.
c. Płukanie filtru - pozwala na usunięcie niezhybrydyzowanej sondy co jest warunkiem
specyficznego obrazu hybrydyzacji.
.gif)
6. Ustalenie położenia fragmentów , do których zhybrydyzowała sonda z użyciem
autoradiografii , reakcji barwnych lub fluorescencji.
RÓŻNE TECHNIKI CZYLI TRZY ŁYKI PRAKTYKI
TECHNIKA NORTHERN
Š 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie
Webmaster
 |