![]() |
SEKWENCJONOWANIE - SĄ JUŻ DO TEGO MASZYNY. Sekwencjonowanie - metoda , dzięki której możliwe jest ustalenie sekwencji czyli określenie kolejności nukleotydów. Jeden z etapów analizy genu. Na podstawie sekwencji istnieje możliwość przewidzenia kolejności aminokwasów w białku , które jest kodowane przez dany gen. Są dwie metody sekwencjonowania : - Enzymatyczna - metoda Sangera Na jednoniciowej matrycy syntetyzuje się in vitro DNA. Syteza przebiega od radioaktywnego , oligonukleotydowego startera komplementarnego do 3` końca matrycy. Reakcję wykonuje się równolegle w czterech probówkach , w których oprócz kompletu deoksytrifosforanów nukleotydów (dATP , dCTP , dTTP , dGTP) dodana jest niewielka ilość jednego z nich w postaci dideoksytrifosforanu nukleotydu , co uniemożliwia kontynuowanie reakcji w momencie włączenia takiego nukleotydu w syntetyzowany łańcuch , ponieważ brakuje wtedy grupy hydroksylowej na 3` końcu.
- Chemiczna - metoda Maxama-Gilberta Jest to metoda praktycznie już nie stosowana. Polega na degradacji wyznakowanych na 5` końcu cząsteczek DNA związkami chemicznymi przecinającymi specyficznie wiązania fosfodiestrowe za nukleotydem odpowiadającym określonej zasadzie azotowej. Wynikiem reakcji jest zbiór fragmentów DNA o różnej długości co spowodowane jest takim doborem warunków , że w poszczególnych cząsteczkach przecinane jest tylko jedno lub dwa wiązania. Fragmenty z czterech niezależnych reakcji (dGTP , dGTP i dATP , dCTP , dCTP i dTTP) rozdziela się elektroforetycznie po czym poddaje autoradiografii. Prążki na autoradiogramie odpowiadają fragmentom DNA posiadającym na końcu 5` znakowany fosfor a na końcu 3` określoną zasadę. ![]() Obydwie metody pozwalają na odczytanie sekwencji około 400 do 700 nukleotydów w jednym doświadczeniu. Jeśli sekwencjonujemy dłuższy odcinek należy go pociąć enzymem restrykcyjnym i ustalać sekwencję każdego fragmentu osobno.
![]() Š 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie Webmaster ![]() |