TECHNIKA SOUTHERN

(DNA-DNA) - hybrydyzacja DNA w celu identyfikacji określonego fragmentu DNA.

Etapy :

1. Izolacja i oczyszczanie DNA z komórek lub tkanek.
Jeżeli musimy wyizolować DNA z tkanki lub organizmu pierwszym etapem będzie homogenizacja czyli roztarcie na jednolitą masę. Nie jest to konieczne gdy materiałem są komórki w roztworze np. bakterie w pożywce czy krew. Następne etapy są na ogół dość podobne. Obejmują cykl dodawania różnych roztworów (np. lizozymu - enzymu niszczącego ściany komórkowe w przypadku bakterii , detergentów destabilizujących błony komórkowe itp.) , wielokrotnego wirowania a także jeśli zachodzi potrzeba podczyszczania preparatu z białek (np. denaturacja przy użyciu fenolu) i RNA (np. wytrącanie octanem amonu i trawienie RNazą).

2. Trawienie DNA odpowiednimi restryktazami.

3. Rozdział elektroforetyczny fragmentów DNA według wielkości i ich denaturacja in situ. Po rozdziale na żelu DNA zostaje zdenaturowany pod wpływem NaOH a następnie poddaje się go działaniu roztworu neutralizującego o pH 7,4.

4. Przeniesienie fragmentów DNA z żelu na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy z zachowaniem ich charakterystycznego rozmieszczenia. Umożliwia to siła ssąca bibuły przy transferze kapilarnym. Możliwy jest także elektrotransfer. Następnie DNA zostaje związany z filtrem przez zapiekanie w 80°C lub przez naświetlanie UV.

5. Hybrydyzacja z sondą.
a. Prehybrydyzacja - polega na moczeniu filtru w odpowiednim roztworze , którego składniki blokują miejsca mogące związać kwasy nukleinowe na filtrze. Nylon i nitroceluloza , z których produkuje się filtry mają wysokie powinowactwo do jednoniciowego DNA czy RNA. Po przeniesieniu badanego materiału jest to już cecha niekorzystna. W celu zminimalizowania tła wynikającego z hybrydyzacji sondy do losowych cząsteczek DNA lub RNA dodaje się również niehomologiczne DNA nośnikowe. Od tego etapu uzależniona jest czułość i specyficzność eksperymentu. Eliminuje niespecyficzne tło. Warunki prehybrydyzacji - stężenie soli , temperatura - są takie same jak właściwej hybrydyzacji.
b. Właściwa hybrydyzacja - w tym właśnie etapie wyznakowana sonda wiąże się z unieruchomionymi na filtrze kwasami nukleinowymi. Dobranie odpowiednich warunków zapewnia specyficzność czyli wiązanie sondy tylko z określonymi fragmentami oraz czułość. W przypadku gdy mamy 100% lub dość wysoką homologię stosujemy ostrzejsze warunki : wyższą temperaturę (65°C) , mniejsze stężenie soli , czasami dodatek formamidu. Gdy homologia jest częściowa , wymagane są mniej ostre warunki : niższa temperatura (55°C) , wyższe stężenie soli. Sondę przed dodaniem należy zawsze zdenaturować w wysokiej temperaturze ponieważ musi być ona w postaci jednoniciowej , co umożliwi jej związanie na filtrze.
c. Płukanie filtru - pozwala na usunięcie niezhybrydyzowanej sondy co jest warunkiem specyficznego obrazu hybrydyzacji.

6. Ustalenie położenia fragmentów , do których zhybrydyzowała sonda z użyciem autoradiografii , reakcji barwnych lub fluorescencji.

RÓŻNE TECHNIKI CZYLI TRZY ŁYKI PRAKTYKI

TECHNIKA NORTHERN


Š 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie                 Webmaster

This server is running Apache