![]() |
TECHNIKA WESTERN BLOT (białko-przeciwciało) - wiązanie przeciwciała w celu identyfikacji określonego białka. ![]() Etapy : 1. Przygotowanie ekstraktów komórkowych. Metody stosowane przy izolacji i oczyszczaniu białek są bardzo różnorodne a ich wybór zależy od właściwości danego białka. 2. Rozdział białek w żelach poliakrylamidowych. W zależności od zastosowanego układu można uzyskać rozdział polipeptydów stosownie do różnych właściwości fizykochemicznych. Przyjmuje się , że elektroforeza w obecności SDS (dodecylosiarczan sodowy) - detergent - frakcjonuje białka zależnie od ich masy czyli zarazem długości łańcucha polipeptydowego. Eliminuje efekt różnicowania pod względem kształtu. SDS powoduje denaturację białka , dysocjację podjednostek (rozbija wiązania niekowalencyjne) i opłaszczenie. Około1,4 gr SDS wiąże się z 1 gr białka. Ten typ elektroforezy jest najczęściej stosowany i może być użyty jako metoda analityczna lub stanowić element szeregu dalszych badań. Złożem , w którym następuje rozdział jest żel poliakrylamidowy. Z reguły do rozdziału białek używana jest szczególna wersja elektroforezy tzw. elektroforeza nieciągła , która umożliwia maksymalne wykorzystanie zdolności rozdzielczych tej metody. W praktyce oznacza to , że zarówno żel składa się jakby z dwóch warstw (żel rozdzielający i zatężający różniące się składem procentowym) jak również bufor do elektroforezy inny jest w górnym inny w dolnym zbiorniku aparatu do elektroforezy. Próbki nakładane na żel mogą mieć stosunkowo dużą objętość ponieważ w czasie przechodzenia przez górną warstwę żelu zostają zagęszczone do wąskiego pasma aby w dolnym żelu ulec rozdzieleniu na pojedyncze , ostre prążki. Dzięki temu , że frakcjonowanie zachodzi w zależności od długości łańcucha polipeptydowego jesteśmy w stanie ustalić masę cząsteczkową danego białka przez porównywanie z odpowiednimi standardami o znanych masach , z dokładnością do 5-10%. 3. Renaturacja. Inkubacja z odpowiednim buforem. 4. Transfer białek z żelu na membranę nitrocelulozową. Z reguły elektrotransfer. 5. Immunoblotting. Jednym z niebezpieczeństw jest to , że białka zaadsorbowane do nitrocelulozy mogą mieć
nieco zmieniony układ przestrzenny aminokwasów a ponieważ rozdzielane są w żelu w
formie zdenaturowanej a następnie muszą ulec renaturacji , mogą w ogóle nie przyjmować
swojej natywnej postaci. Najczęściej są to II (drugorzędowe) przeciwciała czyli przeciwciała , dla których antygenem jest przeciwciało specyficzne. II przeciwciała związane są z barwnikami fluorescencyjnymi , cząstkami złota lub enzymami. Systemy detekcyjne muszą być proste i czułe. Można wykryć za ich pomocą nawet 10-9 do 10-12 gr białka. II przeciwciała mogą być skoniugowane z enzymem , który zmienia kolor substratu podczas reakcji np. z AP - alkaliczną fosfatazą (w zależności od użytego substratu utworzony związek jest ciemno niebieski lub purpurowy) lub z HRP - peroksydazą szczurzą (utlenienie odpowiednich substratów prowadzi do powstawania ciemnego strątu w miejscu reakcji). Innym systemem detekcji jest awidyna lub streptawidyna skoniugowana z enzymem (AP lub HRP). Awidyna i streptawidyna silnie wiążą się z biotyną. I przeciwciała znakuje się biotyną a zamiast II przeciwciał do detekcji używa się awidyny lub streptawidyny skoniugowanej z enzymem. Ponieważ jedna cząsteczka awidyny lub streptawidyny związana jest z kilkoma cząsteczkami enzymu system detekcji jest bardziej czuły niż w przypadku użycia przeciwciał. Następny system to tzw. system NIP. Stworzony aby ograniczyć ilość niespecyficznych
reakcji II przeciwciał. I przeciwciała znakuje się nitrojodofenolem (NIP) , II przeciwciała
skoniugowane z enzymem są skierowane przeciwko NIP. Ponieważ NIP jest związkiem
drobnocząsteczkowym reakcja przeciwciał jest bardzo specyficzna.
Kolejny rodzaj to systemy nieenzymatyczne. Na przykład II przeciwciała wyznakowane
koloidalnym złotem lub radioaktywnie (125I). W pierwszym przypadku uzyskuje się
bezpośrednie uwidocznienie reakcji , w drugim detekcja wymaga autoradiografii.
ZNAKOWANIE W CELU WIZUALIZACJI WYNIKU
![]() Š 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie Webmaster ![]() |