![]() |
REKOMBINOWANE DNA W MEDYCYNIE I FARMACJI Pierwszym udanym eksperymentem tego typu było wyprodukowanie ludzkiego białka - somatostatyny - 14 aminokwasowego neurotransmitera peptydowego. Gen kodujący somatostatynę został zsyntetyzowany chemicznie i sklonowany w wektorze plazmidowym eksprymowanym w E.coli. Pierwszym komercyjnym produktem była ludzka insulina. Obecnie dzięki technologii rekombinowanego DNA uzyskiwane są białka wykorzystywane w leczeniu szeregu chorób : raka , alergii , chorób autoimmunologicznych , neurologicznych , atakach serca , chorobach krwi , infekcjach , chorobach genetycznych. Całkiem nowe podejście do produkcji leków wyrosło właśnie z technologii rekombinacji DNA , gdy uczeni uzyskali możliwość tworzenia subtelnych zmian w naturalnych białkach usprawniających ich funkcjonowanie i zwiększających użyteczność. Techniki i metody stosowane w inżynierii genetycznej wykorzystuje się przy produkcji : - szeregu enzymów - biologicznie czynnych białek (interferony , czynniki krzepnięcia) - antybiotyków (penicylina , streptomycyna) - hormonów (insulina , somatotropina , somatostatyna). Ponadto znalazły one zastosowanie przy : - mapowaniu chromosomów - wykrywaniu mutacji punktowych np. beta-talasemii , fenyloketonurii , dystrofii mięśniowej Duchenne`a) - wykrywaniu submikroskopowych delecji , insercji czy translokacji - badaniu RFLP m.in. w przypadku koagulopatii , mukowiscydozy itd. RFLP - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych. Indywidualne genomy ludzkie różnią się między sobą - występuje polimorfizm genetyczny. Odcinki DNA uzyskane po trawieniu restrykatazami są charakterystyczne dla każdego genomu. Udało się w przypadku niektórych chorób o podłożu genetycznym skorelować mutację powodującą stratę bądź uzyskanie miejsca restrykcyjnego z występowaniem choroby. ![]() ![]() INŻYNIERIA GENETYCZNA W MEDYCYNIE I FARMACJI PROFILAKTYKA
1. Szczepionki zawierające żywe atenuowane drobnoustroje (atenuacja przez wprowadzenie do genomu ściśle określonych mutacji delecyjnych). Przykłady : 2. Szczepionki podjednostkowe : - białka rekombinacyjne - wektory pochodzenia wirusowego zrekombinowane z genami kodującymi immunogenne białka organizmu patogennego - białka syntetyczne. Przykłady : - nowa szczepionka antykrztuścowa - fragment genu Clostridium tetani kodujący domenę toksyny odpowiedzialną za jej immunogenność sklonowano w komórkach E.coli - szczepionka przeciwko wirusowi żółtaczki Hepatitis B produkowana w komórkach drożdży dzięki ekspresji antygenu otoczki wirusowej : gen białka otoczki został wstawiony w wysokokopijny wektor drożdżowy , wirusowe białko było produkowane w dużej ilości. 3. Profilaktyka genowa tzw. III generacja szczepionek : - podanie czystego genu - nagie szczepionki. Przykłady : - wstrzyknięcie do mięśni szkieletowych DNA wirusa grypy w formie plazmidu indukuje powstanie specyficznych cytotoksycznych limfocytów T. Szczepionki otrzymane metodami rekombinacji DNA są stabilne a ich stosowaniu nie towarzyszą niepożądane objawy , proces wytwarzania jest bezpieczny. Preparaty można stosunkowo szybko modyfikować i dostosowywać do zmian cech patogennego organizmu.
Strategia większości szczepionek nowotworowych polega na dostarczeniu antygenów nowotworowych wraz z odpowiednim sygnałem kostymulującym co ma na celu swoistą aktywację układu odpornościowego przeciwko komórkom przerzutowym nowotworu. Powstała koncepcja nowej generacji szczepionek nowotworowych genetycznie modyfikowanych. Strategia polega na pobraniu i izolacji komórek nowotworowych od chorego , wprowadzeniu genu czynnika immunomodulującego (cytokiny , antygeny nowotworowe itp.) , namnożeniu in vitro i podaniu podskórnym choremu lub bezpośrednio do guza. Jako nośnika genów używane są rekombinowane wirusy , głównie retrowirusy i adenowirusy. Podejmowane są próby w profilaktyce głównie czerniaka złośliwego , raka nerki , białaczki , raka płuc i piersi. DIAGNOSTYKA
- sondy genetyczne - diagnozowanie bez konieczności namnażania mikroorganizmów - PCR - wykrywanie minimalnej ilości mikroorganizmów.
Lista chorób , które można obecnie rozpoznawać wykorzystując techniki analizy DNA obejmuje już w tej chwili dobrze ponad sto jednostek chorobowych , m.in. są to : achondroplazja, hemofilia , fenyloketonuria , anemia sierpowata , talasemie , mukowiscydoza i in. - diagnostyka prenatalna m.in. RFLP - choroby nowotworowe. TERAPIA
Przykłady : 1. Insulina - pierwszy lek uzyskany technikami inżynierii genetycznej , który uzyskał licencję. Insulina używana wcześniej w leczeniu cukrzycy , uzyskiwana z trzustek świni i krów , nie była identyczna z ludzką. Dlatego też niektórzy pacjenci wytwarzali przeciwciała przeciwko temu białku. Insulina stworzona dzięki inżynierii genetycznej jest identyczna z ludzką. Eksprymowana jest w komórkach E.coli. Poprzednio łańcuchy A i B były produkowane oddzielnie a następnie fałdowane w dojrzałą cząsteczkę insuliny. Obecnie w celu produkcji komercyjnej , eksprymowane jest pojedyncze fuzyjne białko , które następnie jest przecinane i w taki sposób uzyskuje się w jednym kroku dojrzałą , zrekombinowaną insulinę. 2. Ludzki hormon wzrostu (hGH) - produkowany w komórkach bakteryjnych na dwa sposoby. Skonstruowano wektor ekspresyjny używając cDNA kodującego większość aminokwasów i dodano syntetyczny oligonukleotyd początkowy. Hormon był eksprymowany wewnątrzkomórkowo. Drugim sposobem było dodanie na początku genu sekwencji sygnałowej , która umożliwiła transport białka do przestrzeni peryplazmatycznej skąd łatwo można było uwolić hormon za pomocą dysrupcji hypotonicznej zewnętrznej błony. 3. Tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) jest produkowany komercyjnie w ssaczych kulturach komórkowych. Sklonowano ludzkie cDNA tego genu , wstawiono pod silny promotor i terminator. Wektorem została stabilnie stransfekowana linia komórek ssaczych. Linie wysoko eksprymujące to białko hodowane są w dużych fermentatorach a zrekombinowany tPA jest oczyszczany z pożywki. 4. Czynnik VIII , niezbędny do prawidłowego krzepnięcia krwi , jest także produkowany przez ssacze komórki. Od wielu lat hemofilitykom podawano ten czynnik oczyszczany z ludzkiej krwi. Przyczyniło się to w pewien sposób do rozszerzenia pandemii AIDS. Obecnie cDNA genu tego białka zostało sklonowane. Podobnie jak tPA , czynnik VIII jest dużym kompleksem białkowym , który prawidłowo może być składany i produkowany tylko w komórkach ssaczych.
Terapia genowa poprzedzona musi być sklonowaniem odpowiedniego genu , identyfikacją jego sekwencji regulacyjnych i komórek , w których działa oraz wyborem wydajnych metod ich transfekcji. Powinno się także przeprowadzić badania , które bezsprzecznie dowiodą , że wprowadzony prawidłowy gen działa zgodnie z przewidywaniami a także nie narusza metabolizmu zrówno komórki , do której go wprowadzono jak i całego organizmu. Możliwe są dwa warianty terapii : albo wprowadza się kilka dodatkowych kopii prawidłowego genu albo wymienia gen defektywny na prawidłowy. Metody wprowadzenia genu także są dwie : albo pobiera się docelowe komórki z organizmu pacjenta , modyfikuje genetycznie in vitro , po czym powtórnie wprowadza do organizmu albo wprowadza się gen bezpośrednio do całego organizmu lub tkanki. Trudności : - kłopoty ze znalezieniem wydajnego systemu transfekcji komórek eukariotycznych - charakter ekspresji wprowadzonych genów niestety najczęściej jest przejściowy. Podejmuje się próby leczenia : - chorób spowodowanych defektem w pojedynczym genie - chorób wielogenowych (układu krążenia , nerwowego , nowotwory) - autoagresywnych chorób układu odpornościowego. Przykłady : - Próba wyznakowania genetycznego limfocytów odseparowanych z litego guza chorego. Wprowadzono do limfocytów marker (gen oporności na neomycynę) co pozwoliło na śledzenie ich losów po powtórnym wstrzyknięciu , następnie po ponownym pobraniu transfekowano je in vitro genami kodującymi czynnik martwicy nowotworów i interleukinę 2. - Próba leczenia SCID (ciężki złożony niedobór immunologiczny). Do krwioobiegu wprowadzono limfocyty transfekowane wektorem retrowirusowym z prawidłowym genem. Rezultatem była odporność na antygeny i pojawienie się przeciwciał. - Próba leczenia hemofilii B. Wprowadzono gen czynnika IX do hemocytoblastów za pośrednictwem wektorów retrowirusowych. - Próba leczenia rodzinnej hipercholesterolemii. Przy udziale wektora adenowirusowego wprowadzono gen kontrolujący syntezę receptora LDL do hepatocytów. - Próbowano także wyleczyć niedobór somatotropiny przy udziale wektora retrowirusowego przenosząc geny do hepatocytów. Terapia genowa nie została do tej pory wprowadzona do praktyki klinicznej. Bardzo istotnymi dla rozwoju wielu z powyższych zastosowań okazały się m.in. technologie :
![]() Różnorodność nowych technologii skłania do zastanowienia się nad praktycznie nieograniczonymi możliwościami ich ingerencji , w pozytywnym tego słowa znaczeniu , w życie współczesnego człowieka.
![]() Š 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie Webmaster ![]() |