![]() |
ZNAKOWANIE W CELU WIZUALIZACJI WYNIKU Wiele metod biologii molekularnej opiera się na wykorzystaniu wyznakowanych cząsteczek kwasów nukleinowych. Dobra sonda powinna mieć wysoką aktywność , odpowiednią czystość i specyficzność. Najpowszechniej wykorzystywane do znakowania są cząsteczki nukleotydów, w których jeden z atomów zastąpiony został izotopem radioaktywnym. Aktywność specyficzna zależy od proporcji włączonych nukleotydów radioaktywnych do normalnych. Krótszy okres półtrwania izotopu również powoduje zwiększenie aktywności specyficznej. Najczęściej stosowane są dwa izotopy : fosfor 32P (włączany w pozycji a lub g cząsteczki trifosforanu nukleotydu) oraz siarka 35S (włączana w miejsce atomu tlenu odpowiedniej reszty fosforanowej - a lub g). Fosforu radioaktywnego używa się gdy wymagane jest uzyskanie sondy o wysokiej aktywności co zapewnia dużą czułość i krótki czas detekcji. Podstawowym zastosowaniem siarki jest sekwencjonowanie DNA a także badanie metabolizmu białek.
W zależności od konkretnego zastosowania stosuje się różne metody znakowania DNA :
- Znakowanie 5` końca. W tej metodzie używa się kinazy polinukleotydowej faga T4 , która przenosi grupę fosforanową z pozycji g ATP na DNA lub RNA zawierające grupę hydroksylową na 5` końcu. - Znakowanie 3` końca. Terminalna transferaza dołącza deoksyrybonukleotydy na 3` końcu. Nie wymaga matrycy. Substratem dla tego enzymu może być zarówno jednoniciowe jak i dwuniciowe DNA. - Wypełnianie lepkich końców. W tej metodzie używa się fragmentu Klenowa , który dobudowuje brakujące na 3` końcu nukleotydy w cząsteczkach strawionych enzymami restrykcyjnymi tworzącymi lepkie końce 5`. Wydajność inkorporacji sięga niekiedy nawet 90%. Po znakowaniu niezbędne jest oddzielenie niewłączonych radioaktywnych dNTP , które mogłyby ujemnie wpływać na jakość hybrydyzacji dając zbyt wysokie tło czyli zmniejszając specyficzność reakcji. Rozdzielenie uzyskuje się przez sączenie na kolumienkach ze specjalnym złożem , które zatrzymuje związki drobnocząsteczkowe przepuszczając makrocząsteczki. Ilościowe oznaczenie wyznakowania osiąga się przez pomiar aktywności sondy. Jest on możliwy za pomocą dwóch urządzeń : licznika Geigera i licznika scyntylacyjnego . Zliczają one zarejestrowane rozpady promieniotwórcze w jednostce czasu. Jednostką podstawową jest cps - (counts per second) zliczenie na sekundę lub dpm - (disintegrations per minute) liczba rozpadów promieniotwórczych na minutę. Wykrywanie wizualne wyznakowanych cząsteczek w celu zlokalizowania prążka , który z sondą zhybrydyzował jest możliwe dzięki autoradiografii. Starszą metodą jest poddanie naświetlaniu kliszy pokrytej emulsją fotograficzną czułą na napromieniowanie w specjalnych kasetach. Klisza położona na filtr ulega zaczernieniu w miejscu hybrydyzacji z sondą. Kasetę taką przechowuje się przez pewnien czas , odwrotnie proporcjonalny do aktywności sondy , w temperaturze - 70°C. Niska temperatura sprzyja ostrości prążków. Następnie klisza jest wywoływana. Nowszą metodą jest ekspozycja filtru w innych kasetach. Jest tu niezbędne specjalne urządzenie tzw. phosphoimager sprzężony z komputerem , który umożliwia zeskanowanie powierzchni kasety i obróbkę uzyskanych w ten sposób danych. Przy pomocy programu komputerowego Image Quant jesteśmy w stanie oszacować nawet intensywność zaczernienia.
ELEKTROFOREZA - WĘDRÓWKA W ŻELU
![]() Š 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie Webmaster ![]() |