PCR - Z MAŁEJ ILOŚCI DUŻA ILOŚĆ W KRÓTKIM CZASIE.

PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction) polega na przeprowadzeniu wielu cykli syntezy DNA z wykorzystaniem starterów flankujących określony odcinek DNA o długości od kilkuset do kilku tysięcy nukleotydów. Jest to metoda alternatywna do klonowania i może być używana w celu amplifikacji nawet bardzo rzadkich sekwencji w mieszaninie ale warunkiem jest znajomość sekwencji otaczającej powielany fragment. W praktyce wystarczy tylko jedna cząsteczka matrycy.

Typowa reakcja PCR polega na powtarzających się cyklach :

1. DNA jest denaturowany termicznie w temperaturze około 90°C. Syntetyczne oligonukleotydy długości mniej więcej 20 nukleotydów komplementarne do 3` końców kawałka DNA , którego powieleniem jesteśmy zainteresowani , dodane są w dużym nadmiarze molowym do zdenaturowanego DNA.

2. Temperatura zostaje obniżona do 40-60°C. DNA pozostaje zdenaturowany ponieważ komplementarne łańcuchy są w zbyt niskiej koncentracji , w porównaniu z ilością starterów , aby zrenaturować. Specyficzne oligonukleotydy hybrydyzują z komplementarnymi sekwencjami w DNA (tzw. annealing) i służą jako startery do syntezy DNA , którą prowadzi termostabilna DNA polimeraza tzw. Taq polimeraza izolowana z bakterii Thermus aqaticus.

3. Synteza odbywa się w temperaturze 72°C.

Następnie cała mieszanina jest podgrzewana znowu do 95°C aby rozdysocjować nowo powstałe dupleksy DNA. Później temperatura jest obniżana i zachodzi następna runda syntezy. W pierwszym cyklu reakcji syntetyzowane są odcinki DNA o różnej długości. Stopniowo zaczynają przeważać fragmenty ograniczone straterami a końcowy produkt jest praktycznie jednorodny. W każdym cyklu liczba kopii sekwencji pomiędzy primerami rośnie wykładniczo jak 2n gdzie n jest liczbą cykli.


Amplifikacja fragmentu DNA metodą PCR.

Numer
cyklu

Liczba dwuniciowych , zamplifikowanych cząsteczek DNA

1

0

2

0

3

2

4

4

5

8

6

16

7

32

8

64

9

128

10

256

11

512

12

1024

13

2048

14

4096

15

8192

16

16 384

17

32 768

18

65 536

19

131 072

20

262 144

21

524 288

22

1 048 576

23

2 097 152

24

4 194 304

25

8 388 608

26

16 777 216

27

33 544 432

28

67 108 864

29

134 217 728

30

268 435 456

31

536 870 912

32

1 073 741 824

Po powieleniu DNA może być poddany analizie restrykcyjnej , hybrydyzacyjnej czy sekwencjonowaniu.

ZASTOSOWANIE :

PCR może być używany do amplifikacji specyficznych sekwencji na DNA izolowanym nawet z pojedynczej komórki. Ma to ogromne znaczenie przy :

- analizowaniu mutacji związanych z szeregiem chorób genetycznych

- diagnostyce chorób dziedzicznych

- ustalaniu ojcostwa w sądownictwie

- ustalaniu pochodzenia śladów krwi , włosów itp. w kryminalistyce

- namnażaniu DNA z mumii egipskich czy szczątków wymarłych organizmów

- wykrywania we krwi obecności wirusów takich jak np. HIV.

RODZAJE PCR :

RAPD-PCR - polega na amplifikacji przypadkowo wybranych fragmentów genomu dzięki zastosowaniu krótkich starterów (około 10 nukleotydów) o losowo dobranej sekwencji.

Na pewno zwiążą się one z DNA w jakimś miejscu a ponieważ jednorazowo do każdej reakcji dodawany jest jeden rodzaj startera zakłada się występowanie sekwencji typu odwróconych powtórzeń w takiej odległości od siebie w genomie , która pozwoli na wydajną amplifikację czyli 300 do 1500 par zasad. Elektroforetyczny obraz prążków jest charakterystyczny dla osobnika. Ten rodzaj PCR znalazł zastosowanie w określaniu stopnia pokrewieństwa między organizmami a także m.in. w kryminalistyce w celach identyfikacji.

RT-PCR - PCR połączona z odwrotną transkrypcją czyli materiałem wyjściowym do namnażania jest mRNA a nie jak zazwyczaj DNA.

ZAZĘBIONA PCR - umożliwia zamplifikowanie odcinka DNA zawartego w większym uprzednio namnożonym fragmencie.

PCR in situ - nowa technika pozwalająca na przeprowadzenie reakcji w tkance bez naruszania jej struktury np. na preparacie mikroskopowym.

PCR ILOŚCIOWA - za pomocą pomiaru intensywności reakcji barwnych jesteśmy w stanie zmierzyć po określonej liczbie cykli ilość powstałego produktu. Jest to szczególnie istotne dla substancji występujących w bardzo niewielkich ilościach. Można w ten sposób szacować poziom ekspresji genu kodującego konkretne białko mierząc ilość mRNA.

 



SEKWENCJONOWANIE - SĄ JUŻ DO TEGO MASZYNY

WSZYSTKO CO BIOTECHNOLOG MUSI MIEĆ W LABORATORIUM I NIE TYLKO


Š 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie                 Webmaster

This server is running Apache