TRANSKRYPCJA

Transkrypcja to proces, w którym informacja zawarta w DNA - zapisana w formie sekwencji deoksyrybonukleotydów - przepisana zostaje na język rybonukleotydów w pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA) podczas reakcji katalizowanej przez enzym zwany polimerazą II RNA.

Jak już wspomniano, każdy z etapów ekspresji jest bardzo złożony. Sama transkrypcja nie jest wyjątkiem, dzieli się ją bowiem dalej na trzy następujące po sobie zdarzenia:

  • inicjację transkrypcji,
  • elongację łańcucha pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA),
  • terminację.

Inicjacja transkrypcji

Zanim będzie można przejść do omawiania tytułowego zagadnienia, należy zapoznać się z budową genu eukariotycznego, który jest jednostką kodującą białko. Takie ujęcie znaczenia genu może być bardzo mylące, gdyż sugeruje ono, że cały gen ( od pierwsze go do ostatniego nukleotydu ) niesie informację o strukturze białka.

W rzeczywistości jednak takie wskazówki zawarte są jedynie we fragmentach genu zwanych egzonami. W obrębie tej części genu, która zostanie przepisana na mRNA oprócz egzonów występują również fragmenty będące najczęściej nic nie znaczącymi wtrętami. Określa się je mianem intronów. Jakkolwiek w czasie transkrypcji te "zbędne" fragmenty przepisywane są tak samo jak egzony na nić pierwotnego mRNA ( pre-mRNA ), tak przed zajściem translacji są one eliminowane.

Gen oprócz obszaru transkrybowanego zawiera jeszcze promotor i terminator odpowiednio na swoim 5' i 3' końcu, przy czym jedno i drugie należy pojmować raczej jako obszary funkcjonalne a nie jedynie strukturalne.


Schemat budowy genu eukariotycznego na przykładzie genu ssaczego i drożdżowego ( z uwzględnieniem elementów regulatorowych )

Inicjacja transkrypcji to ten moment, w którym odbywa się najbardziej precyzyjna kontrola ekspresji. To, czy dany gen w konkretnej komórce zostanie w danym momencie wyrażony, tzn. czy zostanie zsyntetyzowane określone białko, zależy w głównej mierze od tego, czy transkrypcja zostanie zapoczątkowana. Oczywiście zdarza się, że transkrypcja zachodzi, ale na dalszych etapach ekspresja zostaje wygaszona, czego skutkiem jest brak syntezy białka. Jednakże generalnie inicjacja transkrypcji jest głównym punk tem kontrolnym ekspresji.

Jako inicjację określa się zdarzenia zachodzące w obrębie promotora, a także daleko położonych rejonów zwanych enhancerami ( wzmacniaczami ), które umożliwiają polimerazie II RNA podjęcie działania.W przeciwieństwie do prokariontów u polimeraza II RNA wymaga do zapoczątkowania reakcji obecności pewnych białek, które określa się mianem czynników transkrypcyjnych tzw. TF-ów ( ang. transcription factors ). Białka te w określonym porządku wiążą się do DNA w obrębie promotora, enhancerów bądź silencerów.

To właśnie ich obecność lub brak w danej komórce ( czy tkance ) decyduje w znacznej mierze o rozpoczęciu lub też nie transkrypcji konkretnego genu. Oprócz białek na transkrypcję mogą również wpływać hormony.

Należy tu jednak zaznaczyć, że jakkolwiek TF-y są istotne w regulacji ekspresji informacji genetycznej, tak najważniejsza jest struktura chromatyny. Wiadomo, że aby zaszła transkrypcja danego genu musi mieć do niego dostęp "aparat enzymatyczny". Jeś li gen jest łatwo dostępny i komórka dysponuje odpowiednimi TF-ami, transkrypcja zachodzi. Jeżeli natomiast gen jest "ukryty" przed polimerazą nic nie pomoże obecność optymalnego zestawu czynników transkrypcyjnych. To, czy dany gen jest łatwo czy trudno d ostępny zależy od tego jaka jest struktura chromatyny w rejonie, w którym występuje. Im silniejsza jest jej kondensacja tym mniejsza możliwość przyłączenia enzymu. Okazuje się, że w różnych tkankach różne rejony DNA są mocno skondensowane ( sheterochroma tynizowane ). Tak więc, jeżeli wiadomo, że konkretny gen w danej tkance nie ulega transkrypcji z dużym prawdopodobieństwem można stwierdzić, że obszar w którym się lokuje jest niedostępny dla aparatu transkrypcyjnego.

 

Rejony DNA o funkcjach regulacyjnych

Sterowanie transkrypcją - przez związanie czynników białkowych czy hormonalnych - może odbywać się z różnych miejsc na DNA. Miejsca te mogą leżeć w obrębie genów ( promotory ), lub też w odległości kilku tys. nukleotydów ( enhancery, silencery ).

Promotory

Obszar promotorowy genu znajduje się na jego 5' końcu i zawiera kilka istotnych rejonów rozpoznawanych przez polimerazę II RNA ( najbliżej miejsca startu transkrypcji ) oraz czynniki transkrypcyjne. Spośród wspomnianych rejonów najistotniejszym i na jbardziej powszechnym jest kaseta TATA ( tzw. TATA-box ). Jest to 7-nukleotydowa sekwencja położona w odległości ok. 25 p.z. od miejsca startu transkrypcji, która w pełni prezentuje się następująco: 5'- TATAAAA -3'. Obecność kasety TATA, choć niezbędna w przypadku prawie wszystkich genów; nie jest wystarczająca, aby z promotora ruszyła transkrypcja. Do pełnej aktywności promotora niezbędne są inne sekwencje występujące w rejonie od -110 do -40

( odległość podana w liczbie nukleotydów na lewo od miejsca startu transkrypcji ). Kaseta TATA stanowi tzw. część rdzeniową promotora. Ponadto promotory genów zawierają inne - nie tak powszechne - sekwencje, które odgrywają znaczącą rolę w poszczególnych tkankach zaopatrzonych w białka rozpoznające owe sekwencje.


Schemat promotora genu eukariotycznego, uwzględniający rejony najbardziej powszechne )

Enhancery i silencery

Enhancery to sekwencje wzmacniające aktywność promotorów. Położone mogą być nawet w znacznej odległości od genu i zachowują zdolność regulacyjną także po eksperymentalnej zmianie orientacji o 180( względem genu. Do enhancerów wiążą się czynniki trans krypcyjne określane jako aktywatory, które odziaływują z polimerazą II RNA i TF-ami promotorowymi. Możliwość oddziaływań enhancer : promotor mimo odległości pomiędzy nimi wynoszącej niekiedy kilka tys. p.z. istnieje dzięki dużej elastyczności nici DNA. Ow a elastyczność objawia się zdolnością DNA do dowolnego wyginania się.


Interakcje enhancer : promotor

Enhancery - rozumiane jako sekwencje -obecne są w każdej komórce ( pamiętamy, że DNA we wszystkich komórkach organizmu jest identyczny ), natomiast tylko w niektórych wykazują aktywność wzmacniającą. Jest to znaczący fakt w regulacji ekspresji info rmacji genetycznej, a bierze się on z różnic w składzie białek komórkowych poszczególnych tkanek. A zatem istnieją enhancery tkankowo-specyficzne wzmagające transkrypcję tylko tam, gdzie obecne są białka wiążące się w ich obrębie. Enhancery mają także is totne znaczenie w regulacji transkrypcji przez hormony steroidowe.

Silencery - ( ang. silence - cisza ), sekwencje służące wyciszeniu aktywności promotora; podobnie jak enhancery mogą być w różnym stopniu oddalone od genu w obu kierunkach, a także występować w jego wnętrzu.

Ciekawą sytuację można zaobserwować w regulacji transkrypcji genów immunoglobulin ( białek syntetyzowanych jedynie w limfocytach B ). W tym przypadku silencer wbudowany jest w obrębie enhancera, a jego znaczenie uwidocznia się w komórkach innych niż limfocyty B. Jest to swoiste zabezpieczenie przed ekspresją genów immunoglobulin związane z inaktywacją enhancera.

Związki sterujące transkrypcją

Regulacja każdego procesu może odbywać się na dwa sposoby: pozytywny bądź negatywny.

Ponieważ w przypadku transkrypcji eukariotycznej lepiej poznano regulację pozytywną najwięcej uwagi zostanie poświęcone aktywatorom, czyli związkom umożliwiającym polimerazie II RNA rozpoczęcie syntezy nici pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA).

A. Czynniki transkrypcyjne wiążące się z promotorem.

Eukariotyczna polimeraza II RNA sama w sobie nie jest zdolna do przyłączenia się do DNA, a co za tym idzie do rozpoczęcia transkrypcji. Zanim enzym zostanie związany w rejonie startu transkrypcji, do promotora przyłączają się kolejno białka zaliczane do grupy TFII ( II stąd, że współpracują z polimerazą II ). Kolejność przyłączania się TF-ów i polimerazy do promotora jest ściśle określona.


Tworzenie kompleksu preinicjacyjnego

Jako pierwszy do DNA wiąże się TFIID. Jest to kompleks, w którego skład wchodzi TBP oraz czynniki towarzyszące TBP tzw. TAF ( TBP associated factors ). TBP to białko wchodzące w bezpośrednią interakcję z DNA w obrębie TATA box. Ma ona postać siodła nasadzającego się na nić kwasu nukleinowego w taki sposob, że jego krańcowe fragmenty wciskają się między pary zasad w DNA. Wnikanie pomiędzy zasady nici komplementarnych powoduje lekkie ( pierwotne ) rozplecenie helisy, konieczne w procesach takich jak omawiana tu transkrypcja, czy też replikacja.

fig. Model przestrzennej budowy TBP

W dalszej kolejności przyłączeniu do promotora ulega TFIIB i polimeraza II RNA ( w kompleksie z TFIIF ). TFIIF nie kontaktuje się z DNA podobnie jak TFIIE przyłączający się do powstałego kompleksu białkowego jako ostatni.

Nazwa czynnika

Funkcje

TFIID - TBP

 

 

Przyłączanie się do TATA box ( rozluźnianie helisy DNA )

Umożliwianie TFIIB przyłączania się do DNA

Regulacyjne ( aktywacja, represja )

TFIIB

Umożliwianie łączenia się kompleksu polimerazy i TFIIF z DNA

TFIIF

Kierowanie polimerazy II RNA do promotora

TFIIE

Stymulacja aktywności TFIIH

TFIIH

Rozplatanie helisy DNA (aktywność helikazy )

Dostarczanie energii niezbędnej do zajścia reakcji ( hydroliza ATP )

Fosforylacja polimerazy ( modyfikacja aktywująca enzym )

Czynniki budujące wraz z polimerazą II RNA kompleks inicjacyjny

Omówiony powyżej kompleks nosi nazwę podstawowego aparatu transkrypcyjnego i mimo tego, iż jest zdolny do przeprowadzenia transkrypcji robi to w znikomym i niewystarczającym do wyraźnej ekspresji genu stopniu. Do promotora (oprócz wymienionych TF-ów ) przyłączają się również białka takie jak, wspomniane wcześniej ssacze Sp1, NF1 oraz szereg innych.

Przykładem białek tkankowo- specyficznych są tzw. OTF2A i OTF2B, które obecne jedynie w limfocytach B - przyłączając się do promotora - umożliwiają ekspresję genów immunoglobulin.

B. Czynniki wiążące się z sekwencjami spoza promotora

Dla transkrypcji, której efektem byłaby intensywna synteza RNA ( warunek wyrażenia genu ) niezbędna jest obecność związków wzmagających transkrypcję podstawową. Są to aktywatory transkrypcji łączące się z DNA w rejonach enhancerowych. Kierunki oddzi aływań aktywatorów obrazuje poniższy rysunek.


Kierunki oddziaływań aktywatorów transkrypcji

Jak widać, aktywatory mogą wpływać bezpośrednio na białka aparatu podstawowego, bądź też za pośrednictwem koaktywatorów. Związki aktywujące mogą mieć różny charakter: białkowy ( w przeważającej części ), lub też steroidowy.

Czynniki białkowe stale obecne w danej tkance są dla niej charakterystyczne i swoje funkcje w połączeniu z enhancerem mogą spełniać tylko w niej.

Czynniki steroidowe, a konkretnie hormony takie jak np.glukokortykoidy pojawiają się w odpowiedzi na bodźce środowiskowe i są transportowane z miejsc syntezy do komórek docelowych. Hormon, który dociera do komórki przeznaczenia wiąże się z receptore m ( nie wszystkie komórki mają receptory na produkowane przez organizm hormony ) i tak powstały układ - hormon : receptor - przyłącza się do enhancera regulując w ten sposób transkrypcję.


Aktywowanie transkrypcji przez układ hormon : receptor

Podsumowując:

1. Inicjacja transkrypcji jest momentem najbardziej precyzyjnej kontroli ekspresji genu.

2. Transkrypcja może zachodzić na różnych poziomach:

  • podstawowym ( niskim ),
  • zaktywowanym ( intensywnym ) w zależności od składu czynników transkrypcyjnych w danej tkance.

3. Regulacja transkrypcji zależna jest do czynników:

  • wewnętrznych (struktura chromatyny w rejonie występowania określonego genu, obecność kompletu TF-ów);
  • zewnętrznych - odpowiedź sprowokowana bodźcami ze środowiska np. hormonalna.

Synteza nici pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA)

Po spełnieniu wszystkich warunków koniecznych do rozpoczęcia reakcji przez polimerazę II RNA, następuje synteza łańcucha pre-mRNA ( czyli prekursora mRNA) w kierunku od 5' do 3' końca. Trankrypcja jednego fragmentu katalizowana jest przez jedną cząs teczkę enzymu.

Budowa polimerazy II RNA

Eukariotyczne polimerazy II RNA składają się z 8 (12 podjednostek ( tzn. różnych polipeptydów ), są więc enzymami wysoce złożonymi. Wspólną ich cechą jest obecność podjednostek RPB1, 2, 5, 6, 8, z których pierwsze dwie są dużymi białkami o masach cząsteczkowych odpowiednio 220 i 140 kDa. Na C-końcu ( końcu karboksylowym białka ) podjednostki RPB 1 występuje w zmiennej ( w zależności od organizmu ) liczbie powtórzeń sekwencja 7-aminokwasowa, która okazuje się być niezbędna do działania enzymu. Jak do tej pory nie określono funkcji poszczególnych podjednostek enzymu eukariotycznego w odróżnieniu od enzymu prokariotycznego, w którym zdefiniowano rolę każdej z podjednostek.

Polimeraza II RNA zlokalizowana jest w nukleoplazmie i oprócz syntezy mRNA przeprowadza tam również syntezę snRNA ( ang. small nuclear RNA ) tj. cząsteczek, o których mowa będzie przy okazji splicingu.

Jak działa polimeraza II RNA?

Jak wiadomo zadaniem polimerazy II RNA jest przepisywanie informacji zawartej w genie ( DNA ) na język RNA. Informacja ta ( dotycząca struktury białek ) zapisana jest tylko w jednej nici DNA, w tzw. nici kodującej. Druga nić - komplementarna - nie niesie informacji o białku, a stanowi matrycę dla polimerazy, która syntetyzuje pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA) na zasadzie komplementarności. Zasada ta polega na wbudowywaniu do powstającej nici informacyjnego RNA nukleotydu adeninowego (A) jeśli w odczytywanym miejscu na mat rycy obecny jest nukleotyd tyminowy (T), guaninowego (G) jeśli na matrycy jest cytozynowy (C) itd.(Tabela)

Nukleotyd na matrycy

Nukleotyd włączany do pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA)

A

U

T

A

G

C

C

G

A zatem transkrypt jest komplementarny do nici matrycowej i homologiczny z nicią kodującą.

Należy jednak pamiętać, że jakkolwiek homologami G, C i A w pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA) są rybonukleotydy niosące te same zasady azotowe, to homologiem T jest rybonukleotyd zawierający uracyl (U) a nie tyminę.

Porównanie sekwencji pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA) z sekwencjami nici kodującej i matrycowej genu.
( kolorem czerwonym oznaczono nić kodującą, a zielonym nić matrycową )

5'- A A T C G G C A T G C C A T G G C C T T G C G C T A - 3' Gen

3'- T T A G C C G T A C G G T A C C G G A A C G C G A T - 5'

5'- A A U C G G C A U G C C A U G G C C U U G C G C U A - 3' pre-mRNA

Zgodnie z tym co zostało powiedziane, enzym syntetyzujący pre-mRNA sunąc po DNA dobiera odpowiednie rybonukleotydy i przyłącza je kolejno w kierunku 5'- 3'( tzn. do wolnej grupy 3'OH pierwszego nukleotydu przyłączona zostaje 5' grupa fosforanowa kol ejnego nukleotydu ). Kierunek ten obowiązuje w każdej reakcji polimeryzacji kwasów nukleinowych i wynika z mechanizmu tworzenia wiązań między sąsiadującymi ze sobą nukleotydami - wiązań fosfodiestrowych. ( Patrz. Chemiczne podstawy biologii molekularnej. ) Polimeraza RNA jest enzymem wprowadzającym więcej pomyłek od polimerazy DNA ponieważ nie wykazuje właściwości korekcyjnych, stąd przepisanie informacji z DNA na RNA nie jest tak wierne jak z DNA na DNA w procesie replikacji. Brak systemów korekcyjnych w transkrypcji nie niesie ze sobą dla komórki poważnych konsekwencji, gdyż nieprawidłowa cząsteczka mRNA jest jedną wśród wielu prawidłowych.

Synteza łańcucha pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA) zaczyna się zwykle od związania przez enzym nukleotydu guaninowego lub adeninowego, do których przyłączane są kolejne ,, cegiełki''.


Struktura kapów

Bardzo charakterystycznym dla eukariontów zjawiskiem jest tworzenie w pierwotnym transkrypcie struktury czapeczki ( ang. cap ) wpływającej na podniesienie stabilności pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA). Proces ten zachodzi równolegle z transkrypcją i jest jednym z etap ów obróbki pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA)( inne rodzaje obróbki zachodzą po zsyntetyzowaniu całej nici pierwotnego mRNA i zostaną omówione osobno ). Transkrypt uposażony w czapeczkę jest mniej wrażliwy na działanie nukleaz i fosfataz tj. enzymów odpowiedzialnych za degradację kwasu nukleinowego. Rozpoznanie cap jest także istotne w inicjacji translacji.

Mechanizm tworzenia czapeczki obejmuje 3 zasadnicze etapy:

- modyfikację trifosforanu 5' końca ( patrz. "Struktura białek i kwasów nukleinowych" ) przez uwolnienie jednej z reszt fosforanowych na drodze hydrolizy;

- przyłączenie GTP wiązaniem 5'-5'- trifosforanowym;

- metylacja guaniny w pozycji N7 tj. przyłączenie reszty metylowej (-CH3 ) do atomu azotu 7-go w cząsteczce guaniny w wyniku reakcji:

reakcja

metylacja reszt cukrowcowych (rybozy) kolejnych nukleotydów może wygenerować kolejne czapeczki (1, 2).

Wydłużanie łańcucha pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA) kończy się w miejscach terminacji, które dosyć dokładnie poznane są u Procaryota, natomiast nadal słabo scharakteryzowane u organizmów wyższych.

Podsumowanie:

1. Transkrypcją rządzi zasada komplementarności.

2. Wydłużanie nici pre-mRNA (zobacz i porównaj: mRNA) zachodzi w kierunku 5'-> 3'.

3. Równolegle z elongacją pierwotnego transkryptu zachodzi modyfikacja jego 5' końca tj. tworzenie struktury czapeczki.

4. Produktem reakcji katalizowanej przez polimerazę II RNA jest pre-mRNA tzn. cząsteczka zawierająca introny.



EKSPRESJA INFORMACJI GENETYCZNEJ

OBRÓBKA PRE-mRNA


Š 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie                 Webmaster

This server is running Apache