IZOLACJA Z ŻELU CZYLI JAK ODZYSKAĆ DNA.

Izolacja z żelu jest niezbędnym etapem w szeregu doświadczeń. Jest konieczna gdy po rozdziale pragniemy wykorzystać do dalszej pracy pewną określoną frakcję materiału lokującego się w odpowiednim prążku.

Istnieje wiele metod odzyskiwania DNA z żeli jednak żadna z nich nie jest pozbawiona wad.

Istotne problemy przy izolacji to :

- obecność inhibitorów reakcji enzymatycznych np. obecne w agarozie zanieczyszczenia w postaci polisacharydów , które hamują aktywność enzymów używanych przy dalszej obróbce klonowanego DNA

- niezbyt duża skuteczność odzyskiwania dużych fragmentów DNA ponieważ wydajność izolowania jest funkcją ciężaru cząsteczkowego tych fragmentów , za wielkość graniczną dla dobrej izolacji przyjmuje się długość 5 kb

- im mniejsza ilość DNA na żelu tym mniejsza wydajność jego odzyskiwania , izolacja staje się nieskuteczna przy ilościach mniejszych niż 500 ng

- nie ma możliwości izolacji jednocześnie kilku fragmentów o różnej długości.

Metody :

1. Izolacja DNA z użyciem DEAE-celulozy.

Polega na przyczepieniu się migrującego DNA do umieszczonej w żelu membrany z DEAE-celulozą , którą następnie odpłukuje się z zanieczyszczeń buforem o niskiej sile jonowej a potem eluuje z niej DNA buforem o wysokiej sile jonowej. Należy pamiętać , że z membran nie podlega elucji jednoniciowe DNA oraz fragmenty powyżej 15 kb.

2. Elektroelucja do woreczków dializacyjnych.

Najefektywniejsza do izolacji dużych fragmentów DNA - powyżej 5 kb. Po odpowiednim rozdzieleniu wycina się konkretny prążek DNA , umieszcza w woreczku dializacyjnym , który wkłada się do aparatu do elektroforezy i prowadzi ją przez jakiś czas po czym na krótko odwraca się bieguny i prowadzi elektroforezę przez minutę co pozwala na uwolnienie DNA ze ścian woreczka. Woreczek dializacyjny zostaje przepłukany odpowiednim buforem i po dodaniu kilku specjalnych odczynników i wirowaniu otrzymujemy preparat DNA.

3. Metoda “freeze-sqeeze”.

Jest to bardzo szybka metoda izolacji. Tak jak poprzednio po elektroforezie zostaje z żelu wycięty konkretny prążek. Fragment żelu umieszczony w probówce , na dnie której znajduje się niewielka ilość silikonowej szklanej waty , zamraża się w ciekłym azocie (freeze) a następnie wkłada się jedną probówkę w drugą po zrobieniu w tej pierwszej niewielkiego otworku na dnie. Kolejnym etapem jest wirowanie (sqeeze). Uzyskany w ten sposób bufor poddaje się jeszcze kilku zabiegom wytrącania i wirowania , po których otrzymujemy wyizolowane DNA.



ELEKTROFOREZA - WĘDRÓWKA W ŻELU

SEKWENCJONOWANIE - SĄ JUŻ DO TEGO MASZYNY


Š 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie                 Webmaster

This server is running Apache