WEKTOR PO ŁACINIE ZNACZY PRZEWOŹNIK.

WEKTOR - cząsteczka DNA mogąca być nośnikiem interesującego nas kawałka DNA , która posiada zdolność do autonomicznej replikacji w danym typie komórek. Zapewnia powielanie wprowadzonego fragmentu DNA czyli klonowanie a czasami także wydajną synt ezę kodowanego przez gen białka (transkrypcję i translację oraz jego stabilność) jak to ma miejsce w tzw. wektorach ekspresyjnych. Są różne typy wektorów a dobranie odpowiedniego zależy m.in. od tego w jakich komórkach zamierzamy klonować gen. Najważniejszym elementem warunkującym specyficzność wektora są sekwencje odpowiedzialne za inicjację replikacji tzw. sekwencje ori. Najprostsze wektory posiadały wyłącznie jedno , unikalne miejsce restrykcyjne , w które można było wprowa dzić obcy DNA. Obecnie najczęściej jest to tzw. polilinker - syntetyczny odcinek DNA , w którym znajduje się zwykle kilkanaście miejsc rozpoznawanych przez różne restryktazy.
Pozwala to na swobodniejszy dobór odpowiedniego do klonowania enzymu. Wektory zazwyczaj posiadają również geny markerowe czyli geny kodujące białka odpowiedzialne za łatwo wyróżnialne cechy fenotypowe. Wektor mus i być tak skonstruowany aby istniała możliwość selekcji tych komórek , do których wniknął. Jego budowa powinna pozwalać także na odróżnienie wektora zrekombinowanego od takiego , który zamknął się bez ligacji z fragmentem DNA.

WEKTORY PLAZMIDOWE BAKTERYJNE.

Budowa - nieduże , koliste cząsteczki DNA zawierające ori replikacji , gen markera selekcyjnego (najczęściej oporność na antybiotyk) oraz miejsce do klonowania.

Wektory plazmidowe wprowadzane są do komórek bakterii przy wykorzystaniu zjawiska transformacji. W przypadku stosowanej najczęściej bakterii - E.coli wymaga to zwiększenia przepuszczalności błon komórkowych czyli ukompetentnienia. W tym c elu wystawia się komórki na wysoką koncentrację pewnych dwuwartościowych kationów. W typowej procedurze komórki traktuje się roztworem chlorku wapnia. Zazwyczaj 1 komórka na milion zostaje stransformowana. 1 cząsteczka na tysiąc zrekombinowanych plazmidów transformuje komórkę bakteryjną. Każda kompetentna komórka inkorporuje tylko jeden plazmid. Selekcję zazwyczaj uzyskuje się na dwa sposoby. Pierwszy z nich to obecność w plazmidzie dwóch genów oporności na dwa różne antybiotyki przy czym w j ednym z nich znajduje się miejsce do klonowania. Komórka , która nie pobrała plazmidu będzie wrażliwa na obydwa antybiotyki , taka , która pobrała plazmid niezrekombinowany będzie oporna na obydwa. Komórka , która ma plazmid z fragmentem obcego DNA będzie wrażliwa na antybiotyk , w którego genie było miejsce restrykcyjne , ponieważ ciągłość genu zostanie przerwana co unieczynni produkowane białko. Drugi sposób to system selekcji opierający się na tzw. teście alfa-komplementacji. Polilinkery większości wek torów umiejscowione są w obrębie genu kodującego a peptyd b-galaktozydazy. Transformowane są bakterie , które mają mutację akurat we fragmencie genu kodującym tą część enzymu. Umożliwia to selekcję na odpowiedniej pożywce bakterii , które pobrały zrekombi nowany plazmid ponieważ tylko one będą białe w odróżnieniu od tych , w których zaszła komplementacja mutacji i sprawny enzym rozkłada substrat dodany w pożywce co powoduje niebieskie zabarwienie kolonii.

Pojedyncze komórki bakteryjne , utworzą kolonie a wszystkie plazmidy w takiej kolonii będą pochodziły od jednego plazmidu wprowadzonego do komórki , która tą kolonię założyła. Powstanie więc klon a fragment DNA na plazmidzie to sklonowany DNA.

Pojemność wektorów plazmidowych ograniczona jest sposobem wprowadzania rekombinacyjnych cząstek DNA do komórek gospodarza. Przy klasycznej transformacji wielkość wstawki nie powinna być większa niż około 10 kb.

Warto zwrócić jeszcze uwagę na ilość kopii wektora w komórce. Istnieją wektory niskokopijne i wysokokopijne co uzależnione jest od rodzaju ori.

Klonowanie w wektorze plazmidowym polega na przecięciu go stosownym enzymem restrykcyjnym , defosforylacji jego końców w celu wyeliminowania możliwości recyrkularyzacji samego wektora oraz ligacji , którą to reakcję przeprowadza ligaza DNA tworz ąca standardowe wiązanie fosfodiestrowe , z odpowiednio wcześniej przygotowanymi fragmentami DNA , które chcemy sklonować , pociętymi tą samą restryktazą lub dającą komplementarne końce.

WEKTORY POCHODNE BAKTERIOFAGÓW :

LAMBDOWE - pochodne faga l.

Można w nich klonować większe fragmenty DNA. Inną zaletą jest wyższa wydajność infekcji cząstkami bakteriofagów w porównaniu do wydajności transformacji.Budowa : odpowiednio zmodyfikowany bakt eriofag l. Wprowadzono mutacje punktowe w niektórych genach zmieniające właściwości ich produktów : krótkie delecje oraz niekiedy usunięcie środkowego regionu DNA odpowiedzialnego za cykl lizogenny. Z DNA faga można usunąć około 30% genomu pozostawiając j ego lewe i prawe ramię zawierające wszystkie geny niezbędne w cyklu litycznym. Dzięki 12 nukleotydowym , wzajemnie komplementarnym , jednoniciowym fragmentom DNA na końcach cząsteczki DNA faga - tzw. sekwencjom cos - możliwe jest przybranie przez D NA faga w komórce bakteryjnej formy kolistej oraz zapakowanie go w białkową główkę. Również w te wektory wstawione są polilinkery , geny markerowe , silne promotory i inne.

Są dwa rodzaje wektorów lambdowych , co spowodowane jest faktem , że do białkowej główki pakowane jest DNA długości 75% do 105% długości DNA faga typu dzikiego :

  • replacement - tak skonstruowane , że centralny region jest oflankowany identycznym zestawem miejsc restrykcyjnych tak , że przecięcie daną restryktazą wycina ten region z wektora. Na jego miejsce może być wstawiony obcy DNA długości 9-25 kb. Klonow anie polega na izolacji poszczególnych ramion po wycięciu regionu centralnego i ligacji ze zdefosforylowanymi fragmentami obcego DNA (co uniemożliwia wstawienie dwóch różnych odcinków DNA do jednego wektora) w warunkach sprzyjających tworzeniu konkata merów , następnie pakowaniu in vitro w kapsydy faga i infekcji komórek E.coli.
  • insercyjne - zawierające drobne modyfikacje dzikiego genomu faga. Odcinek obcego DNA musi zawierać się w granicach od 0 do 8 kb. Klonowanie polega na przecięciu odpowiednim enzymem restrykcyjnym w miejscu do klonowania , izolacji poszczególnych ramion i ligacji z fragmentami DNA w warunkach umożliwiających tworzenie konkatamerów , pakowaniu w kapsydy faga i infekcji E.coli.

Wprowadzanie do komórek gospodarza odbywa się z wysoką efektywnością - z reguły 1 na 20 cząsteczek zrekombinowanego wektora jest efektywnie pakowana w kapsyd i wprowadzana do komórek E.coli na drodze transfekcji.

POCHODNE FAGA M13 - szczególny cykl życiowy tego faga pozwala na wykorzystanie go do wytwarzania jednoniciowego DNA czyli kiedy chodzi np. o sekwencjonowanie DNA lub ukierunkowaną mutagenezę.

KOSMIDOWE - stosowane do klonowania dużych fragmentów DNA np. operonów prokariotycznych czy genów eukariotycznych. Budowa : są to zmodyfikowane plazmidy zawierające sekwencję cos faga l konieczną przy pakowaniu DNA do kapsydów fago wych. Najprostsze kosmidy zawierają ori repilkacji , gen markera selekcyjnego , miejsce do klonowania oraz sekwencję cos. Modyfikacje tego typu wektorów polegają na zwiększaniu ilości miejsc do klonowania (polilinkery) , wprowadzaniu element ów umożliwiających analizę klonowanego DNA np. promotorów fagów T3 , T7 itp. , wprowadzeniu elementów umożliwiających propagację wektora w komórkach eukariotycznych tj. ori eukariotyczne , gen markera selekcyjnego dla komórek eukariotycznych oraz w prowadzeniu drugiej sekwencji cos.

Wprowadzanie rekombinowanych cząsteczek wektora jest podobne do infekcji fagowej. DNA wektora zligowanego z odpowiedniej wielkości fragmentami obcego DNA jest in vitro pakowany w kapsydy faga a następnie wprowadzany do komórek gospodarza na drodze transdukcji. Tam kosmidy zachowują się jak plazmidy. Pojemność takiego wektora jest ograniczona obustronnie. Klonowany DNA musi być wielkości od 35 do 45 kb ponieważ do kapsydu może zostać wprowadzo ny DNA nie mniejszy niż 38 kb i nie większy niż 52 kb. Tak więc proces pakowania wymaga powstania układu dwóch sekwencji cos na jednej cząsteczce DNA oddalonych od siebie o 38 do 52 kb. Osiąga się to albo tnąc wektor odpowiednią restryktazą i defos forylowany ligując z odpowiedniej wielkości fragmentami obcego DNA przy wysokim stężeniu DNA i nadmiarze wektora (9:1) co sprzyja powstawaniu konkatamerów albo gdy wektor zawiera dwie sekwencje cos , rozcina się go w dwóch miejscach : w miejscu do klonowania i między sekwencjami cos , następnie liguje się go ze zdefosforylowanymi fragmentami obcego DNA przy wysokim stężeniu ATP co powoduje , że łączenie tępych końców jest bardzo mało wydajne a więc głównym produktem reakcji jest obcy DNA poł ączony z fragmentami wektora.

WEKTORY DROŻDŻOWE. Drożdże jako komórki gospodarzy posiadają niezaprzeczalne zalety : mają struktury komórkowe typowe dla eukariota , geny w nich klonowane mogą zawierać sekwencje intronowe , proces obróbki mRNA jest zbliżony do tego , który wys tępuje u wyższych eukariontów , białka podlegają modyfikacjom posttranslacyjnym. Wynika z tego , że klonować DNA w drożdżach należy wtedy gdy zależy nam na uzyskaniu ekspresji badanego genu w komórce eukariotycznej i odpowiednio zmodyfikowanych białkowych produktów. Występują dwa typy tych wektorów : replikatywne - gdy ori pochodzi z chromosomów drożdży (tzw. sekwencja ars) lub episomalne - gdy ori pochodzi z naturalnie występującego u drożdży plazmidu 2 m.

Poza tym wektory te posiadają geny markerowe oraz polilinkery.

Mogą to być wektory bifunkcjonalne (wahadłowe) czyli mające odrębne miejsca startu replikacji i geny markerowe dla komórek drożdżowych jak i bakteryjnych np. E.coli co umożliwia m.in. klonowanie genów w komórkach bakteryjnych a badanie ich ekspr esji w drożdżach.

Skonstruowano również sztuczne chromosomy drożdżowe czyli YAC. Istnieje możliwość klonowania w nich bardzo dużych fragmentów DNA do 500 kb. YAC posiada sekwencje , które umożliwiają replikację naturalnych chromosomów czyli ars oraz zapewniają se gregację podczas podziału - sekwencje telomerowe i centromerowe , ponadto znajdują się tam geny markerowe i polilinkery.

INNE WEKTORY.

WEKTORY POCHODNE WIRUSA SV40 (Simian Virus) - zbudowane z 500 bp fragmentu DNA wirusa zawierającego ori , promotory genów kodujących wczesne białka wirusa a także sekwencje regulacyjne odpowiedzialne za aktywację transkrypcji z tych prom otorów przez komórkowe czynniki transkrypcyjne. Używany do klonowania w komórkach ssaczych.

WEKTORY POCHODNE RETROWIRUSÓW - stosuje się je w tzw. bezpiecznych układach złożonych. Pierwszy składnik to dwuniciowe DNA z sekwencjami LTR (long terminal repeats - długie końcowe powtórzenia) , pełniącymi funkcję promotorów genów wirusa i niezbęd ne do integracji DNA wirusa z chromosomem gospodarza oraz z sekwencji psi warunkującej pakowanie kwasu nukleinowego do kapsydu. Drugi składnik to linia komórek z prowirusem pozbawionym sekwencji psi a posiadającym geny kodujące białka otoczk i wirusa i odwrotną transkryptazę. Klonowanie w komórkach ssaczych przeprowadza się w ten sposób , że DNA retrowirusa z włączonym do niego obcym genem wprowadza się do specjalnej linii komórkowej , w której produkt jego transkrypcji pakowany jest w otoczk i białkowe , izoluje się je i infekuje nimi komórki docelowe. Tu następuje przepisanie z RNA na DNA , który włączany jest do chromosomu co daje początek transformowanej linii komórkowej.

WEKTORY POCHODNE BAKULOWIRUSÓW - wektor skonstruowany został z sekwencji bakteryjnych ori i genu oporności na antybiotyk a także kasety ekspresyjnej , w skład której w chodzi polilinker i sekwencje regulacyjne genu polihedryny bakulowirus a czyli promotor i terminator. Komórki owadów lub całe larwy transfekuje się mieszaniną DNA bakulowirusa i zlinearyzowanego wektora niosącego zrekombinowany gen i gen markerowy umożliwiający selekcję w komórkach owadów. Wewnątrz komórki dochodzi do homolo gicznej rekombinacji i utworzenia zrekombinowanego wirusa , który zamiast genu polihedryny ma gen , który chcemy sklonować. Dochodzi tu do prawidłowych modyfikacji posttranslacyjnych klonowanych białek. Wydajność produkcji jest dość niska a koszt stosunko wo wysoki. Znajdują one zastosowanie przy produkcji odczynników analitycznych , diagnostycznych i niektórych leków.

WEKTORY POCHODNE ADENOWIRUSÓW - w cyklu rozwojowym wprowadzają wiele kopii DNA do komórki. Informacja genetyczna ulega ekspresji ale nie ulega replikacji ponieważ znajduje się poza DNA gospodarza. W kolejnych pokoleniach komórek wprowadzonego DN A jest coraz mniej. Wprowadzane odcinki DNA nie mogą być zbyt długie. Stosowany do klonowania w komórkach ssaczych.

WEKTORY EKSPRESYJNE :

Zawierają odpowiednio usytuowany silny promotor umożliwiający ekspresję na wysokim poziomie białka , którego gen znajduje się na tym wektorze.

1. Plazmidowe wektory ekspresyjne zawierające silne , regulowane promotory. Taki silny , regulowany promotor powoduje , że w specyficznych warunkach transkrypcja jest inicjowana wiele razy na minutę. Przykładem może być promotor laktozowy. Transkrypcję wzmaga się przez dodanie do pożywki IPTG (analog laktozy).

2. Plazmidowe wektory ekspresyjne zawierające promotor późnych białek faga T7. Promotor genu RNA polimerazy faga T7 to specyficzna sekwencja 23 bp. System ten jest dość skomplikowany. Składa się z dwóch elementów. W zrekombinowanych komórkach E.coli , zawierających gen kodujący T7 RNA polimerazę wstawiony za promotorem laktozowym zachodzi synteza dużej ilości RNA polimerazy gdy do pożywki dodane jest IPTG. Komórki te są transformowane wektorem plazmidowym , który niesie kopię promotora T7 i cDNA genu kodującego wybrane białko. RNA polimeraza wiąże się z promotorem T7 na wektorze plazmidowym co katalizuje transkrypcję wstawionego cDNA.

3. Istnieją także eukariotyczne systemy ekspresyjne. Jest to szczególnie istotne gdy chcemy otrzymać aktywne białko , w którym prawidłowo zostały przeprowadzone modyfikacje posttranslacyjne.

Maksymalna wielkość DNA , który może być sklonowany w wektorach.

Typ wektora

Długość klonowanego DNA (kb

Plazmid

10

Bakteriofag l

25

Kosmid

45

YAC

500



ENZYMY , KTÓRE TNĄ DNA NA FRAGMENTY I ŁĄCZĄ JE POZWALAJĄC NA NIEZLICZONĄ ILOŚĆ KOMBINACJI TYCHŻE.

SCREENING BANKU GENÓW CZYLI IDENTYFIKACJA ODPOWIEDNIEGO KLONU. SZUKANIE IGŁY W STOGU SIANA ?


Š 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie                 Webmaster

This server is running Apache