TECHNIKA WESTERN BLOT

(białko-przeciwciało) - wiązanie przeciwciała w celu identyfikacji określonego białka.


Etapy :

1. Przygotowanie ekstraktów komórkowych.

Metody stosowane przy izolacji i oczyszczaniu białek są bardzo różnorodne a ich wybór zależy od właściwości danego białka.

2. Rozdział białek w żelach poliakrylamidowych. W zależności od zastosowanego układu można uzyskać rozdział polipeptydów stosownie do różnych właściwości fizykochemicznych. Przyjmuje się , że elektroforeza w obecności SDS (dodecylosiarczan sodowy) - detergent - frakcjonuje białka zależnie od ich masy czyli zarazem długości łańcucha polipeptydowego. Eliminuje efekt różnicowania pod względem kształtu. SDS powoduje denaturację białka , dysocjację podjednostek (rozbija wiązania niekowalencyjne) i opłaszczenie. Około1,4 gr SDS wiąże się z 1 gr białka. Ten typ elektroforezy jest najczęściej stosowany i może być użyty jako metoda analityczna lub stanowić element szeregu dalszych badań. Złożem , w którym następuje rozdział jest żel poliakrylamidowy. Z reguły do rozdziału białek używana jest szczególna wersja elektroforezy tzw. elektroforeza nieciągła , która umożliwia maksymalne wykorzystanie zdolności rozdzielczych tej metody. W praktyce oznacza to , że zarówno żel składa się jakby z dwóch warstw (żel rozdzielający i zatężający różniące się składem procentowym) jak również bufor do elektroforezy inny jest w górnym inny w dolnym zbiorniku aparatu do elektroforezy. Próbki nakładane na żel mogą mieć stosunkowo dużą objętość ponieważ w czasie przechodzenia przez górną warstwę żelu zostają zagęszczone do wąskiego pasma aby w dolnym żelu ulec rozdzieleniu na pojedyncze , ostre prążki. Dzięki temu , że frakcjonowanie zachodzi w zależności od długości łańcucha polipeptydowego jesteśmy w stanie ustalić masę cząsteczkową danego białka przez porównywanie z odpowiednimi standardami o znanych masach , z dokładnością do 5-10%.

3. Renaturacja.

Inkubacja z odpowiednim buforem.

4. Transfer białek z żelu na membranę nitrocelulozową.

Z reguły elektrotransfer.

5. Immunoblotting.

Jednym z niebezpieczeństw jest to , że białka zaadsorbowane do nitrocelulozy mogą mieć nieco zmieniony układ przestrzenny aminokwasów a ponieważ rozdzielane są w żelu w formie zdenaturowanej a następnie muszą ulec renaturacji , mogą w ogóle nie przyjmować swojej natywnej postaci.
a. Zablokowanie miejsc niespecyficznych.
b. Inkubacja ze specyficznymi dla poszukiwanego białka przeciwciałami.
c. Inkubacja z odczynnikiem używanym do detekcji.

Najczęściej są to II (drugorzędowe) przeciwciała czyli przeciwciała , dla których antygenem jest przeciwciało specyficzne. II przeciwciała związane są z barwnikami fluorescencyjnymi , cząstkami złota lub enzymami. Systemy detekcyjne muszą być proste i czułe. Można wykryć za ich pomocą nawet 10-9 do 10-12 gr białka. II przeciwciała mogą być skoniugowane z enzymem , który zmienia kolor substratu podczas reakcji np. z AP - alkaliczną fosfatazą (w zależności od użytego substratu utworzony związek jest ciemno niebieski lub purpurowy) lub z HRP - peroksydazą szczurzą (utlenienie odpowiednich substratów prowadzi do powstawania ciemnego strątu w miejscu reakcji). Innym systemem detekcji jest awidyna lub streptawidyna skoniugowana z enzymem (AP lub HRP). Awidyna i streptawidyna silnie wiążą się z biotyną. I przeciwciała znakuje się biotyną a zamiast II przeciwciał do detekcji używa się awidyny lub streptawidyny skoniugowanej z enzymem. Ponieważ jedna cząsteczka awidyny lub streptawidyny związana jest z kilkoma cząsteczkami enzymu system detekcji jest bardziej czuły niż w przypadku użycia przeciwciał.

Następny system to tzw. system NIP. Stworzony aby ograniczyć ilość niespecyficznych reakcji II przeciwciał. I przeciwciała znakuje się nitrojodofenolem (NIP) , II przeciwciała skoniugowane z enzymem są skierowane przeciwko NIP. Ponieważ NIP jest związkiem drobnocząsteczkowym reakcja przeciwciał jest bardzo specyficzna. Kolejny rodzaj to systemy nieenzymatyczne. Na przykład II przeciwciała wyznakowane koloidalnym złotem lub radioaktywnie (125I). W pierwszym przypadku uzyskuje się bezpośrednie uwidocznienie reakcji , w drugim detekcja wymaga autoradiografii.

TECHNIKA NORTHERN

ZNAKOWANIE W CELU WIZUALIZACJI WYNIKU


Š 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie                 Webmaster

This server is running Apache