![](/file/14483/www_10_1998.iso/poland/bmwi/lab_b.gif)
TECHNIKA SOUTHERN
(DNA-DNA) - hybrydyzacja DNA w celu identyfikacji okre╢lonego fragmentu DNA.
Etapy : 1. Izolacja i oczyszczanie DNA z kom≤rek lub tkanek.
Je┐eli musimy wyizolowaµ DNA z tkanki lub organizmu pierwszym etapem bΩdzie
homogenizacja czyli roztarcie na jednolit▒ masΩ. Nie jest to konieczne gdy materia│em s▒
kom≤rki w roztworze np. bakterie w po┐ywce czy krew. NastΩpne etapy s▒ na og≤│ do╢µ
podobne. Obejmuj▒ cykl dodawania r≤┐nych roztwor≤w (np. lizozymu - enzymu niszcz▒cego
╢ciany kom≤rkowe w przypadku bakterii , detergent≤w destabilizuj▒cych b│ony kom≤rkowe
itp.) , wielokrotnego wirowania a tak┐e je╢li zachodzi potrzeba podczyszczania preparatu z
bia│ek (np. denaturacja przy u┐yciu fenolu) i RNA (np. wytr▒canie octanem amonu i
trawienie RNaz▒). 2. Trawienie DNA odpowiednimi restryktazami. ![](/file/14483/www_10_1998.iso/poland/bmwi/(7-22).gif) 3. Rozdzia│ elektroforetyczny fragment≤w DNA wed│ug wielko╢ci i ich denaturacja in situ.
Po rozdziale na ┐elu DNA zostaje zdenaturowany pod wp│ywem NaOH a nastΩpnie poddaje
siΩ go dzia│aniu roztworu neutralizuj▒cego o pH 7,4.
4. Przeniesienie fragment≤w DNA z ┐elu na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy z zachowaniem
ich charakterystycznego rozmieszczenia. Umo┐liwia to si│a ss▒ca bibu│y przy transferze
kapilarnym. Mo┐liwy jest tak┐e elektrotransfer. NastΩpnie DNA zostaje zwi▒zany z filtrem
przez zapiekanie w 80░C lub przez na╢wietlanie UV. 5. Hybrydyzacja z sond▒.
a. Prehybrydyzacja - polega na moczeniu filtru w odpowiednim roztworze , kt≤rego sk│adniki
blokuj▒ miejsca mog▒ce zwi▒zaµ kwasy nukleinowe na filtrze. Nylon i nitroceluloza ,
z kt≤rych produkuje siΩ filtry maj▒ wysokie powinowactwo do jednoniciowego DNA czy
RNA. Po przeniesieniu badanego materia│u jest to ju┐ cecha niekorzystna. W celu
zminimalizowania t│a wynikaj▒cego z hybrydyzacji sondy do losowych cz▒steczek DNA
lub RNA dodaje siΩ r≤wnie┐ niehomologiczne DNA no╢nikowe. Od tego etapu
uzale┐niona jest czu│o╢µ i specyficzno╢µ eksperymentu. Eliminuje niespecyficzne t│o.
Warunki prehybrydyzacji - stΩ┐enie soli , temperatura - s▒ takie same jak w│a╢ciwej
hybrydyzacji.
b. W│a╢ciwa hybrydyzacja - w tym w│a╢nie etapie wyznakowana sonda wi▒┐e siΩ z
unieruchomionymi na filtrze kwasami nukleinowymi. Dobranie odpowiednich warunk≤w
zapewnia specyficzno╢µ czyli wi▒zanie sondy tylko z okre╢lonymi fragmentami oraz
czu│o╢µ. W przypadku gdy mamy 100% lub do╢µ wysok▒ homologiΩ stosujemy ostrzejsze
warunki : wy┐sz▒ temperaturΩ (65░C) , mniejsze stΩ┐enie soli , czasami dodatek
formamidu. Gdy homologia jest czΩ╢ciowa , wymagane s▒ mniej ostre warunki : ni┐sza
temperatura (55░C) , wy┐sze stΩ┐enie soli. SondΩ przed dodaniem nale┐y zawsze
zdenaturowaµ w wysokiej temperaturze poniewa┐ musi byµ ona w postaci jednoniciowej ,
co umo┐liwi jej zwi▒zanie na filtrze.
c. P│ukanie filtru - pozwala na usuniΩcie niezhybrydyzowanej sondy co jest warunkiem
specyficznego obrazu hybrydyzacji.
![](/file/14483/www_10_1998.iso/poland/bmwi/(7-17).gif)
6. Ustalenie po│o┐enia fragment≤w , do kt≤rych zhybrydyzowa│a sonda z u┐yciem
autoradiografii , reakcji barwnych lub fluorescencji.
R╙»NE TECHNIKI CZYLI TRZY úYKI PRAKTYKI
TECHNIKA NORTHERN
⌐ 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie
Webmaster
![This server is running Apache](/file/14483/www_10_1998.iso/poland/bmwi/apache_p.gif) |