Schemat obrazuj▒cy procesy zachodz▒ce na drodze od DNA do mRNA

Polimeraza poli A dodaje na 3' ko±cu pierwotnego transkryptu kolejne nukleotydy adeninowe dopiero po zadzia│aniu specyficznej nukleazy tj. enzymu tn▒cego kwas nukleinowy w obrΩbie jego cz▒steczki. Okazuje siΩ bowiem, ┐e ogon poli A nie jest do│▒czan y do ostatniego nukleotydu wbudowanego na drodze transkrypcji, a do tego, kt≤ry sta│ siΩ ostatnim po rozciΩciu nici pre-mRNA (zobacz i por≤wnaj: mRNA). Miejsce atakowane przez nukleazΩ nie jest dowolne, wyznacza je sekwencja: AAUAAA po│o┐ona w r≤┐nej odleg│o╢ci od przeznaczonego m iejsca dzia│ania enzymu.

I tak na przyk│ad u ssak≤w ciΩcie nastΩpuje w odleg│o╢ci 10 - 30 nukleotyd≤w za sekwencj▒ AAUAAA.

Mechanizm poliadenylacji pre-mRNA (zobacz i por≤wnaj: mRNA)

Istniej▒ geny zawieraj▒ce wiΩcej ni┐ jeden sygna│ poliadenylacji ( tj.wspomnian▒ sekwencjΩ ). Oznacza to, ┐e na ich matrycy powstanie kilka pierwotnych transkrypt≤w r≤┐ni▒cych siΩ d│ugo╢ci▒ , a co za tym idzie kilka r≤┐nych mRNA. Przyk│adem alterna tywnej poliadenylacji mo┐e byµ modyfikacja pierwotnego transkryptu szczurzego genu koduj▒cego kalcytoninΩ.

Gen ten zawiera dwa miejsca poliadenylacji, z kt≤rych pierwsze preferowane jest w kom≤rkach tarczycy a drugie w m≤zgu.

Ogon poli A podobnie jak struktura czapeczki chroni cz▒steczkΩ pierwotnego transkryptu przed dzia│aniem nukleaz. Mo┐e on mieµ r≤wnie┐ znaczenie w translacji, okazuje siΩ bowiem, ┐e transkrypt pozbawiony ogona poli A jest mniej wydajn▒ matryc▒ przy sy ntezie bia│ka.

Zanim powstanie ostateczny, dojrza│y mRNA mog▒cy ulec translacji, pre-mRNA musi zostaµ pozbawiony intron≤w. Proces wycinania tych niekoduj▒cych "wtrΩt≤w" zwany jest splicingiem i wykorzystuje jeden wsp≤lny dla eliminacji wszystkich intron≤w aparat enzymatyczny.

Oznacza to, ┐e introny musz▒ mieµ jakie╢ wsp≤lne elementy rozpoznawane przez wspomniany aparat splicingowy. Z por≤wnywania sekwencji r≤┐nych intron≤w wynika, ┐e │▒cz▒ je nastΩpuj▒ce podobie±stwa:

• na 5' ko±cu zawieraj▒ zawsze kolejno: resztΩ guaninow▒ i uracylow▒ (5'- GU)
• na ich 3' ko±cu wystΩpuje reszta guaninowa poprzedzona reszt▒ adeninow▒ (AG - 3')
• wewn▒trz zawieraj▒ tzw. miejsce rozga│Ωzienia, w kt≤rym kluczow▒ dla splicingu rolΩ odgrywa nukleotyd adeninowy.

Sygna│y splicingowe

Mechanizm splicingu

Wycinanie intron≤w, jak ka┐dy proces przeprowadzany przez organizm ┐ywy, jest skomplikowane. Wyr≤┐niµ w nim mo┐na kilka etap≤w:

1. RozciΩcie cz▒steczki pre-mRNA w miejscu splicingowym 5' (tj. na 5' ko±cu intronu).W wyniku tej reakcji nastΩpuje uwolnienie 5' ko±ca fosforanowego egzonu 1.

2. Atak grupy 2'-OH nukleotydu adeninowego ( z miejsca rozga│Ωzienia ) na 5' grupΩ fosforanow▒ nukleotydu guaninowego intronu. Jak wiadomo wi▒zania miΩdzy kolejnymi nukleotydami to wi▒zania fosfodiestrowe tworzone miΩdzy tzw. 5' grup▒ fosforanow▒ a gru p▒ hydroksylow▒ ( -OH ) rybozy. Zwykle do wi▒zania tego anga┐owana jest grupa 3'-OH, niemniej jednak inne reszty hydroksylowe m.in. 2' posiadaj▒ zdolno╢µ do interakcji z reszt▒ fosforanow▒. I tak nukleotyd adeninowy ( z miejsca rozga│Ωzienia ) maj▒c grup Ω 3'-OH wykorzystan▒ w "normalnym" wi▒zaniu fosfodiestrowym do interakcji z reszt▒ fosforanow▒ 5' intronu anga┐uje grupΩ 2'-OH. Tworzy siΩ tu wi▒zanie 2'-5' fosfodiestrowe.

3. Atak uwolnionej grupy 3'-OH egzonu 1 na 5' grupΩ fosforanow▒ egzonu 2 z uwolnieniem intronu maj▒cego postaµ lassa.

Mechanizm splicingu pre-mRNA (kolejno╢µ powstawania wi▒za±)

Spliceosom

Opisane powy┐ej reakcje nie zachodz▒ samoistnie. S▒ one katalizowane przez kompleks przy│▒czaj▒cych siΩ kolejno cz▒stek tworz▒cych spliceosom. W sk│ad aparatu splicingowego wchodzi piΩµ rodzaj≤w snRNP ( snRNA + bia│ka ): U1, U2, U4, U5 i U6, z kt≤ry ch ka┐dy pe│ni odrΩbn▒, istotn▒ funkcjΩ:

U1- │▒czy siΩ z miejscem splicingowym 5'i 3' na zasadzie komplementarno╢ci, zawiera on bowiem w swej rybonukleinowej komponencie sekwencjΩ komplementarn▒ do styk≤w egzon-intron;

U2- wi▒┐e miejsce rozga│Ωzienia;

U6- katalizuje splicing, wystΩpuje w kompleksie z U4 i U5.

Spos≤b dzia│ania spliceosomu

Produktem splicingu jest dojrza│y mRNA nios▒cy same istotne informacje dotycz▒ce budowy bia│ka ( poza fragmentami skrajnymi, kt≤rych g│≤wnym zadaniem jest stabilizacja transkryptu ). Okazuje siΩ jednak, ┐e na matrycy jednego genu mo┐e powstaµ kil ka r≤┐nych mRNA, co poza alternatywn▒ poliadenylacj▒ powodowane jest tzw. alternatywnym splicingiem. Polega on na │▒czeniu ze sob▒ r≤┐nych egzon≤w tzn. niekoniecznie wszystkich wystΩpuj▒cych w pre-mRNA (zobacz i por≤wnaj: mRNA).

Fig.III.2.7. Alternatywny splicing na przyk│adzie (-tropomiozyny szczura

5'NT i 3'NT - obszary nie ulegaj▒ce translacji

Nie wiadomo jeszcze dok│adnie, dlaczego w r≤┐nych tkankach wybierane s▒ odmienne wzory │▒czenia egzon≤w. Byµ mo┐e maszyneria obs│uguj▒ca proces wycinania intron≤w nie jest identyczna we wszystkich rodzajach kom≤rek tzn. wystΩpuj▒ pewne subtelne, ale znacz▒ce r≤┐nice miΩdzy spliceosomami poszczeg≤lnych tkanek. Mo┐liwe jest tak┐e, ┐e podstawowy aparat splicingowy jest uniwersalny, a r≤┐ne tkanki zawieraj▒ dla siebie charakterystyczne czynniki ( bia│kowe lub RN-owe ) │▒cz▒ce siΩ z pre-mRNA, czego konse kwencj▒ mo┐e byµ u│atwienie b▒d╝ utrudnienie dzia│ania spliceosom≤w w r≤┐nych miejscach w obrΩbie pierwotnego transkryptu.

Podsumowuj▒c:

1. Pre-mRNA zanim stanie siΩ pe│nowarto╢ciow▒ matryc▒ do syntezy bia│ka musi przej╢µ przez proces dojrzewania.

2. Dojrzewanie obejmuje 3 zasadnicze modyfikacje:

• capping ( dodawanie czapeczki )
• poliadenylacjΩ podnosz▒c▒ stabilno╢µ transkryptu;
• splicing, w kt≤rym eliminowane s▒ wewnΩtrzne niekoduj▒ce rejony informacyjnego RNA.

3. Alternatywny splicing i poliadenylacja mog▒ generowaµ r≤┐ne produkty ( mRNA ) wykrywane w r≤┐nych tkankach, co znaczy, ┐e jeden gen mo┐e kodowaµ wiΩcej ni┐ jedno bia│ko.

4. Dojrzewanie pre-mRNA jest warunkiem eksportu transkryptu z j▒dra.

5. Dojrza│y mRNA wi▒┐e siΩ z bia│kami maj▒cymi wp│yw na jego stabilno╢µ, transport i translacjΩ.

TRANSKRYPCJA

TRANSLACJA

Webmaster