PCR - reakcja │a±cuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction) polega na przeprowadzeniu wielu cykli syntezy DNA z wykorzystaniem starter≤w flankuj▒cych okre╢lony odcinek DNA o d│ugo╢ci od kilkuset do kilku tysiΩcy nukleotyd≤w. Jest to metoda alternatywna do klonowania i mo┐e byµ u┐ywana w celu amplifikacji nawet bardzo rzadkich sekwencji w mieszaninie ale warunkiem jest znajomo╢µ sekwencji otaczaj▒cej powielany fragment. W praktyce wystarczy tylko jedna cz▒steczka matrycy.

Typowa reakcja PCR polega na powtarzaj▒cych siΩ cyklach :

1. DNA jest denaturowany termicznie w temperaturze oko│o 90░C. Syntetyczne oligonukleotydy d│ugo╢ci mniej wiΩcej 20 nukleotyd≤w komplementarne do 3` ko±c≤w kawa│ka DNA , kt≤rego powieleniem jeste╢my zainteresowani , dodane s▒ w du┐ym nadmiarze molowym do zdenaturowanego DNA.

2. Temperatura zostaje obni┐ona do 40-60░C. DNA pozostaje zdenaturowany poniewa┐ komplementarne │a±cuchy s▒ w zbyt niskiej koncentracji , w por≤wnaniu z ilo╢ci▒ starter≤w , aby zrenaturowaµ. Specyficzne oligonukleotydy hybrydyzuj▒ z komplementarnymi sekwencjami w DNA (tzw. annealing) i s│u┐▒ jako startery do syntezy DNA , kt≤r▒ prowadzi termostabilna DNA polimeraza tzw. Taq polimeraza izolowana z bakterii Thermus aqaticus.

3. Synteza odbywa siΩ w temperaturze 72░C.

NastΩpnie ca│a mieszanina jest podgrzewana znowu do 95░C aby rozdysocjowaµ nowo powsta│e dupleksy DNA. P≤╝niej temperatura jest obni┐ana i zachodzi nastΩpna runda syntezy. W pierwszym cyklu reakcji syntetyzowane s▒ odcinki DNA o r≤┐nej d│ugo╢ci. Stopniowo zaczynaj▒ przewa┐aµ fragmenty ograniczone straterami a ko±cowy produkt jest praktycznie jednorodny. W ka┐dym cyklu liczba kopii sekwencji pomiΩdzy primerami ro╢nie wyk│adniczo jak 2ⁿ gdzie n jest liczb▒ cykli.

Po powieleniu DNA mo┐e byµ poddany analizie restrykcyjnej , hybrydyzacyjnej czy sekwencjonowaniu.

ZASTOSOWANIE :

PCR mo┐e byµ u┐ywany do amplifikacji specyficznych sekwencji na DNA izolowanym nawet z pojedynczej kom≤rki. Ma to ogromne znaczenie przy :

- analizowaniu mutacji zwi▒zanych z szeregiem chor≤b genetycznych

- diagnostyce chor≤b dziedzicznych

- ustalaniu ojcostwa w s▒downictwie

- ustalaniu pochodzenia ╢lad≤w krwi , w│os≤w itp. w kryminalistyce

- namna┐aniu DNA z mumii egipskich czy szcz▒tk≤w wymar│ych organizm≤w

- wykrywania we krwi obecno╢ci wirus≤w takich jak np. HIV.

RODZAJE PCR :

RAPD-PCR - polega na amplifikacji przypadkowo wybranych fragment≤w genomu dziΩki zastosowaniu kr≤tkich starter≤w (oko│o 10 nukleotyd≤w) o losowo dobranej sekwencji.

Na pewno zwi▒┐▒ siΩ one z DNA w jakim╢ miejscu a poniewa┐ jednorazowo do ka┐dej reakcji dodawany jest jeden rodzaj startera zak│ada siΩ wystΩpowanie sekwencji typu odwr≤conych powt≤rze± w takiej odleg│o╢ci od siebie w genomie , kt≤ra pozwoli na wydajn▒ amplifikacjΩ czyli 300 do 1500 par zasad. Elektroforetyczny obraz pr▒┐k≤w jest charakterystyczny dla osobnika. Ten rodzaj PCR znalaz│ zastosowanie w okre╢laniu stopnia pokrewie±stwa miΩdzy organizmami a tak┐e m.in. w kryminalistyce w celach identyfikacji.

RT-PCR - PCR po│▒czona z odwrotn▒ transkrypcj▒ czyli materia│em wyj╢ciowym do namna┐ania jest mRNA a nie jak zazwyczaj DNA.

ZAZ╩BIONA PCR - umo┐liwia zamplifikowanie odcinka DNA zawartego w wiΩkszym uprzednio namno┐onym fragmencie.

PCR in situ - nowa technika pozwalaj▒ca na przeprowadzenie reakcji w tkance bez naruszania jej struktury np. na preparacie mikroskopowym.

PCR ILOªCIOWA - za pomoc▒ pomiaru intensywno╢ci reakcji barwnych jeste╢my w stanie zmierzyµ po okre╢lonej liczbie cykli ilo╢µ powsta│ego produktu. Jest to szczeg≤lnie istotne dla substancji wystΩpuj▒cych w bardzo niewielkich ilo╢ciach. Mo┐na w ten spos≤b szacowaµ poziom ekspresji genu koduj▒cego konkretne bia│ko mierz▒c ilo╢µ mRNA.

SEKWENCJONOWANIE - Sí JU» DO TEGO MASZYNY

WSZYSTKO CO BIOTECHNOLOG MUSI MIE╞ W LABORATORIUM I NIE TYLKO

Webmaster