![]() |
SEKWENCJONOWANIE - Sí JU» DO TEGO MASZYNY. Sekwencjonowanie - metoda , dziΩki kt≤rej mo┐liwe jest ustalenie sekwencji czyli okre╢lenie kolejno╢ci nukleotyd≤w. Jeden z etap≤w analizy genu. Na podstawie sekwencji istnieje mo┐liwo╢µ przewidzenia kolejno╢ci aminokwas≤w w bia│ku , kt≤re jest kodowane przez dany gen. S▒ dwie metody sekwencjonowania : - Enzymatyczna - metoda Sangera Na jednoniciowej matrycy syntetyzuje siΩ in vitro DNA. Syteza przebiega od radioaktywnego , oligonukleotydowego startera komplementarnego do 3` ko±ca matrycy. ReakcjΩ wykonuje siΩ r≤wnolegle w czterech prob≤wkach , w kt≤rych opr≤cz kompletu deoksytrifosforan≤w nukleotyd≤w (dATP , dCTP , dTTP , dGTP) dodana jest niewielka ilo╢µ jednego z nich w postaci dideoksytrifosforanu nukleotydu , co uniemo┐liwia kontynuowanie reakcji w momencie w│▒czenia takiego nukleotydu w syntetyzowany │a±cuch , poniewa┐ brakuje wtedy grupy hydroksylowej na 3` ko±cu.
- Chemiczna - metoda Maxama-Gilberta Jest to metoda praktycznie ju┐ nie stosowana. Polega na degradacji wyznakowanych na 5` ko±cu cz▒steczek DNA zwi▒zkami chemicznymi przecinaj▒cymi specyficznie wi▒zania fosfodiestrowe za nukleotydem odpowiadaj▒cym okre╢lonej zasadzie azotowej. Wynikiem reakcji jest zbi≤r fragment≤w DNA o r≤┐nej d│ugo╢ci co spowodowane jest takim doborem warunk≤w , ┐e w poszczeg≤lnych cz▒steczkach przecinane jest tylko jedno lub dwa wi▒zania. Fragmenty z czterech niezale┐nych reakcji (dGTP , dGTP i dATP , dCTP , dCTP i dTTP) rozdziela siΩ elektroforetycznie po czym poddaje autoradiografii. Pr▒┐ki na autoradiogramie odpowiadaj▒ fragmentom DNA posiadaj▒cym na ko±cu 5` znakowany fosfor a na ko±cu 3` okre╢lon▒ zasadΩ. ![]() Obydwie metody pozwalaj▒ na odczytanie sekwencji oko│o 400 do 700 nukleotyd≤w w jednym do╢wiadczeniu. Je╢li sekwencjonujemy d│u┐szy odcinek nale┐y go poci▒µ enzymem restrykcyjnym i ustalaµ sekwencjΩ ka┐dego fragmentu osobno.
![]() ⌐ 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie Webmaster ![]() |