Izolacja z ┐elu jest niezbΩdnym etapem w szeregu do╢wiadcze±. Jest konieczna gdy po rozdziale pragniemy wykorzystaµ do dalszej pracy pewn▒ okre╢lon▒ frakcjΩ materia│u lokuj▒cego siΩ w odpowiednim pr▒┐ku.

Istnieje wiele metod odzyskiwania DNA z ┐eli jednak ┐adna z nich nie jest pozbawiona wad.

Istotne problemy przy izolacji to :

- obecno╢µ inhibitor≤w reakcji enzymatycznych np. obecne w agarozie zanieczyszczenia w postaci polisacharyd≤w , kt≤re hamuj▒ aktywno╢µ enzym≤w u┐ywanych przy dalszej obr≤bce klonowanego DNA

- niezbyt du┐a skuteczno╢µ odzyskiwania du┐ych fragment≤w DNA poniewa┐ wydajno╢µ izolowania jest funkcj▒ ciΩ┐aru cz▒steczkowego tych fragment≤w , za wielko╢µ graniczn▒ dla dobrej izolacji przyjmuje siΩ d│ugo╢µ 5 kb

- im mniejsza ilo╢µ DNA na ┐elu tym mniejsza wydajno╢µ jego odzyskiwania , izolacja staje siΩ nieskuteczna przy ilo╢ciach mniejszych ni┐ 500 ng

- nie ma mo┐liwo╢ci izolacji jednocze╢nie kilku fragment≤w o r≤┐nej d│ugo╢ci.

Polega na przyczepieniu siΩ migruj▒cego DNA do umieszczonej w ┐elu membrany z DEAE-celuloz▒ , kt≤r▒ nastΩpnie odp│ukuje siΩ z zanieczyszcze± buforem o niskiej sile jonowej a potem eluuje z niej DNA buforem o wysokiej sile jonowej. Nale┐y pamiΩtaµ , ┐e z membran nie podlega elucji jednoniciowe DNA oraz fragmenty powy┐ej 15 kb.

Najefektywniejsza do izolacji du┐ych fragment≤w DNA - powy┐ej 5 kb. Po odpowiednim rozdzieleniu wycina siΩ konkretny pr▒┐ek DNA , umieszcza w woreczku dializacyjnym , kt≤ry wk│ada siΩ do aparatu do elektroforezy i prowadzi j▒ przez jaki╢ czas po czym na kr≤tko odwraca siΩ bieguny i prowadzi elektroforezΩ przez minutΩ co pozwala na uwolnienie DNA ze ╢cian woreczka. Woreczek dializacyjny zostaje przep│ukany odpowiednim buforem i po dodaniu kilku specjalnych odczynnik≤w i wirowaniu otrzymujemy preparat DNA.

Jest to bardzo szybka metoda izolacji. Tak jak poprzednio po elektroforezie zostaje z ┐elu wyciΩty konkretny pr▒┐ek. Fragment ┐elu umieszczony w prob≤wce , na dnie kt≤rej znajduje siΩ niewielka ilo╢µ silikonowej szklanej waty , zamra┐a siΩ w ciek│ym azocie (freeze) a nastΩpnie wk│ada siΩ jedn▒ prob≤wkΩ w drug▒ po zrobieniu w tej pierwszej niewielkiego otworku na dnie. Kolejnym etapem jest wirowanie (sqeeze). Uzyskany w ten spos≤b bufor poddaje siΩ jeszcze kilku zabiegom wytr▒cania i wirowania , po kt≤rych otrzymujemy wyizolowane DNA.

ELEKTROFOREZA - W╩DR╙WKA W »ELU

SEKWENCJONOWANIE - Sí JU» DO TEGO MASZYNY

Webmaster