ZNAKOWANIE W CELU WIZUALIZACJI WYNIKU

ZNAKOWANIE W CELU WIZUALIZACJI WYNIKU

Wiele metod biologii molekularnej opiera siΩ na wykorzystaniu wyznakowanych cz▒steczek kwas≤w nukleinowych. Dobra sonda powinna mieµ wysok▒ aktywno╢µ , odpowiedni▒ czysto╢µ i specyficzno╢µ. Najpowszechniej wykorzystywane do znakowania s▒ cz▒steczki nukleotyd≤w, w kt≤rych jeden z atom≤w zast▒piony zosta│ izotopem radioaktywnym. Aktywno╢µ specyficzna zale┐y od proporcji w│▒czonych nukleotyd≤w radioaktywnych do normalnych. Kr≤tszy okres p≤│trwania izotopu r≤wnie┐ powoduje zwiΩkszenie aktywno╢ci specyficznej. NajczΩ╢ciej stosowane s▒ dwa izotopy : fosfor ³²P (w│▒czany w pozycji a lub g cz▒steczki trifosforanu nukleotydu) oraz siarka ³⁵S (w│▒czana w miejsce atomu tlenu odpowiedniej reszty fosforanowej - a lub g). Fosforu radioaktywnego u┐ywa siΩ gdy wymagane jest uzyskanie sondy o wysokiej aktywno╢ci co zapewnia du┐▒ czu│o╢µ i kr≤tki czas detekcji. Podstawowym zastosowaniem siarki jest sekwencjonowanie DNA a tak┐e badanie metabolizmu bia│ek.

NajczΩ╢ciej u┐ywane radioizotopy.
Radioizotop	Czas p≤│trwania	Energia emitowanych cz▒stek (MeV)	Specyficzna aktywno╢µ wyznakowanych sk│adnik≤w (mCi/mmol)
Tryt	12,35 lat	0,0186	10²-10⁵
WΩgiel - 14	5730 lat	0,156	1 - 10²
Siarka - 35	87,5 dnia	0,167	1 - 10⁶
Fosfor - 33	25,5 dnia	0,248	10 - 10⁴
Fosfor - 32	14,3 dnia	1,709	10 - 10⁵
* MeV = 10⁶ elektronowolt≤w. Powy┐ej podana maksymalna energia.
^{# mCi (miliCurie) - miara liczby rozpad≤w na jednostkΩ czasu. 1 mCi = 2,2^.10⁹ rozpad≤w na minutΩ.}

W zale┐no╢ci od konkretnego zastosowania stosuje siΩ r≤┐ne metody znakowania DNA :

Nick translation - DNaza I wprowadza do cz▒steczki jednoniciowe pΩkniΩcia (nick). Polimeraza I dziΩki swojej aktywno╢ci 5`-3` egzonukleazy usuwa nukleotydy przed sob▒ a za sob▒ dobudowywuje nowe w│▒czaj▒c miΩdzy innymi r≤wnie┐ nukleotydy radioaktywne. W ten spos≤b przesuwa niejako miejsce pΩkniΩcia. Wydajno╢µ inkorporacji wynosi oko│o 50%. Metoda ta daje najlepsze wyniki przy znakowaniu ca│ych plazmid≤w a nie jest raczej zalecana do fragment≤w liniowych.

Random priming - najczΩstsza , oparta jest na hybrydyzacji oligonukleotyd≤w (6 do 9 nukleotyd≤w) o przypadkowej sekwencji do DNA , kt≤ry ma byµ wyznakowany. NastΩpnie polimeraza Klenowa (fragment polimerazy DNA I nie posiadaj▒cy aktywno╢ci egzonukleolitycznej 5`-3`) dosyntetyzowuje komplementarn▒ niµ DNA poczynaj▒c od 3` OH ko±ca przy│▒czonego startera. W mieszaninie reakcyjnej znajduj▒ siΩ tak┐e radioaktywne nukleotydy w│▒czane stopniowo do nowo syntetyzowanej nici. D│ugo╢µ znakowanych fragment≤w nie wp│ywa na wydajno╢µ reakcji. Mo┐na w ten spos≤b uzyskaµ sondΩ o wysokiej aktywno╢ci. Metoda jest doskona│a zar≤wno do znakowania ca│ych plazmid≤w jak i liniowych fragment≤w.

Znakowanie DNA na ko±cach.

- Znakowanie 5` ko±ca.

W tej metodzie u┐ywa siΩ kinazy polinukleotydowej faga T4 , kt≤ra przenosi grupΩ fosforanow▒ z pozycji g ATP na DNA lub RNA zawieraj▒ce grupΩ hydroksylow▒ na 5` ko±cu.

Poniewa┐ normalnie cz▒steczki DNA zawieraj▒ grupΩ fosforanow▒ na 5` ko±cu nale┐y przed znakowaniem poddaµ je dzia│aniu alkalicznej fosfatazy , kt≤ra spowoduje jej usuniΩcie. Metoda najczΩ╢ciej stosowana do znakowania syntetycznych oligonukleotyd≤w.

- Znakowanie 3` ko±ca.

Terminalna transferaza do│▒cza deoksyrybonukleotydy na 3` ko±cu. Nie wymaga matrycy. Substratem dla tego enzymu mo┐e byµ zar≤wno jednoniciowe jak i dwuniciowe DNA.

- Wype│nianie lepkich ko±c≤w. W tej metodzie u┐ywa siΩ fragmentu Klenowa , kt≤ry dobudowuje brakuj▒ce na 3` ko±cu nukleotydy w cz▒steczkach strawionych enzymami restrykcyjnymi tworz▒cymi lepkie ko±ce 5`. Wydajno╢µ inkorporacji siΩga niekiedy nawet 90%.

Po znakowaniu niezbΩdne jest oddzielenie niew│▒czonych radioaktywnych dNTP , kt≤re mog│yby ujemnie wp│ywaµ na jako╢µ hybrydyzacji daj▒c zbyt wysokie t│o czyli zmniejszaj▒c specyficzno╢µ reakcji. Rozdzielenie uzyskuje siΩ przez s▒czenie na kolumienkach ze specjalnym z│o┐em , kt≤re zatrzymuje zwi▒zki drobnocz▒steczkowe przepuszczaj▒c makrocz▒steczki.

Ilo╢ciowe oznaczenie wyznakowania osi▒ga siΩ przez pomiar aktywno╢ci sondy. Jest on mo┐liwy za pomoc▒ dw≤ch urz▒dze± : licznika Geigera i licznika scyntylacyjnego . Zliczaj▒ one zarejestrowane rozpady promieniotw≤rcze w jednostce czasu. Jednostk▒ podstawow▒ jest cps - (counts per second) zliczenie na sekundΩ lub dpm - (disintegrations per minute) liczba rozpad≤w promieniotw≤rczych na minutΩ.

Wykrywanie wizualne wyznakowanych cz▒steczek w celu zlokalizowania pr▒┐ka , kt≤ry z sond▒ zhybrydyzowa│ jest mo┐liwe dziΩki autoradiografii. Starsz▒ metod▒ jest poddanie na╢wietlaniu kliszy pokrytej emulsj▒ fotograficzn▒ czu│▒ na napromieniowanie w specjalnych kasetach. Klisza po│o┐ona na filtr ulega zaczernieniu w miejscu hybrydyzacji z sond▒. KasetΩ tak▒ przechowuje siΩ przez pewnien czas , odwrotnie proporcjonalny do aktywno╢ci sondy , w temperaturze - 70░C. Niska temperatura sprzyja ostro╢ci pr▒┐k≤w. NastΩpnie klisza jest wywo│ywana. Nowsz▒ metod▒ jest ekspozycja filtru w innych kasetach. Jest tu niezbΩdne specjalne urz▒dzenie tzw. phosphoimager sprzΩ┐ony z komputerem , kt≤ry umo┐liwia zeskanowanie powierzchni kasety i obr≤bkΩ uzyskanych w ten spos≤b danych. Przy pomocy programu komputerowego Image Quant jeste╢my w stanie oszacowaµ nawet intensywno╢µ zaczernienia.

TECHNIKA WESTERN BLOT

ELEKTROFOREZA - W╩DR╙WKA W »ELU

⌐ 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie Webmaster