TECHNIKA NORTHERN

(DNA-RNA) - hybrydyzacja DNA w celu identyfikacji

okre╢lonego fragmentu RNA.

Etapy :

1. Izolacja i oczyszczanie RNA z kom≤rek i tkanek.

Typowa kom≤rka eukariotyczna zawiera oko│o 10^-5 mg RNA. 80-85% stanowi▒ rybosomalne RNA (28S , 18S , 5S). Pozosta│e 10-15% to r≤┐ne rodzaje ma│ocz▒steczkowego RNA (tRNA , snRNA i in.). Poszczeg≤lne klasy RNA maj▒ okre╢lon▒ wielko╢µ i mo┐na je izolowaµ w stosunkowo czystej formie za pomoc▒ technik takich jak elektroforeza , wirowanie w gradiencie gΩsto╢ci czy chromatografia jonowymienna. mRNA stanowi 1-5% ca│kowitej ilo╢ci RNA w kom≤rce.

Kom≤rki wszystkich organizm≤w zawieraj▒ rybonukleazy - enzymy bior▒ce udzia│ w r≤┐nych procesach zwi▒zanych z metabolizmem RNA. Aby otrzymaµ niezdegradowany RNA wymagany jest czynnik inaktywuj▒cy RNazy np. DEPC (dietylopirowΩglan). Dodaje siΩ go do wszystkich odczynnik≤w. Ponadto szk│o i sprzΩt , kt≤ry ma bezpo╢redni kontakt z preparatem musi byµ wysterylizowany w odpowiedni spos≤b poniewa┐ RNazy wytrzymuj▒ gotowanie i autoklawowanie. Jest to ochrona przed egzogennymi RNazami. Poprzez inkubacjΩ preparatu z proteinaz▒ K , traktowanie tiocyjanianem guanidyny , kt≤ry denaturuje bia│ka czy merkaptoetanolem , kt≤ry redukuje mostki dwusiarczkowe chroni siΩ preparat przed RNazami endogennymi. Poza tym procedura izolacji RNA jest do╢µ podobna do izolacji DNA.

Bardzo czΩsto interesuje nas tylko jeden rodzaj RNA , mianowicie mRNA. Od reszty oddziela siΩ go metod▒ chromatografii powinowatwa (kolumnowej). Jak wiadomo mRNA ma 3` ko±cu ma ogon poliadenylowy. Wykorzystujemy tu komplementarno╢µ A=T. Wewn▒trz kolumny znajduje siΩ z│o┐e (celuloza , sefaroza) z przy│▒czonymi na powierzchni odcinkami poli-T. Przez kolumnΩ przepuszczany jest roztw≤r ca│kowitego RNA. Adsorbcji ulegn▒ tylko mRNA. Inne rodzaje RNA przep│yn▒ przez kolumnΩ. NastΩpnie po przeprowadzeniu przez kolumnΩ specjalnego buforu powoduj▒cego od│▒czenie mRNA od z│o┐a , otrzymujemy u wylotu sp│ywaj▒cy roztw≤r oczyszczonego mRNA.

2. Elektroforeza RNA w ┐elach.

Z uwagi na siln▒ tendencjΩ RNA do tworzenia skomplikowanych struktur drugo- i trzeciorzΩdowych , kt≤re w znacz▒cy spos≤b mog▒ wp│ywaµ na migracjΩ cz▒steczek w ┐elu , powoduj▒c tym samym rozdzia│ uzale┐niony nie tylko od wielko╢ci (czego chemy unikn▒µ) elektroforeza prowadzona jest w warunkach denaturuj▒cych. NajczΩ╢ciej do tego celu stosuje siΩ mocznik , formaldehyd , formamid lub ╢rodki , kt≤re powoduj▒ odwracaln▒ chemicznie modyfikacjΩ znosz▒c▒ odzia│ywania prowadz▒ce do wytwarzania struktur przestrzennych jak np. roztw≤r glioksalu. Elektroforeza mo┐e byµ przeprowadzana w ┐elach agarozowych lub akrylamidowych.

3. Przeniesienie RNA na filtr (Northern blot).

Technika nie r≤┐ni siΩ zasadniczo od Southern blot.

4. Hybrydyzacja z sond▒ i odp│ukiwanie.

Aby nie nara┐aµ RNA na wysokie temperatury stosuje siΩ w roztworze prehybrydyzacyjnym i hybrydyzacyjnym formamid co pozwala zredukowaµ temperaturΩ do 42░C. Warunki te s▒ odpowiednie dla hybrydyzacji kwas≤w o pe│nej homologii. W samej procedurze nie ma znacz▒cych r≤┐nic w por≤wnaniu z poprzedni▒ technik▒.

5. Autoradiografia. Mo┐liwa jest ilo╢ciowa analiza RNA , co znajduje zastosowanie np. przy por≤wnywaniu ilo╢ci poszczeg≤lnych mRNA w kom≤rce w r≤┐nych warunkach.

TECHNIKA SOUTHERN

TECHNIKA WESTERN BLOT

Webmaster