TECHNIKA SOUTHERN

(DNA-DNA) - hybrydyzacja DNA w celu identyfikacji okre╢lonego fragmentu DNA.

Etapy :

1. Izolacja i oczyszczanie DNA z kom≤rek lub tkanek.
Je┐eli musimy wyizolowaµ DNA z tkanki lub organizmu pierwszym etapem bΩdzie homogenizacja czyli roztarcie na jednolit▒ masΩ. Nie jest to konieczne gdy materia│em s▒ kom≤rki w roztworze np. bakterie w po┐ywce czy krew. NastΩpne etapy s▒ na og≤│ do╢µ podobne. Obejmuj▒ cykl dodawania r≤┐nych roztwor≤w (np. lizozymu - enzymu niszcz▒cego ╢ciany kom≤rkowe w przypadku bakterii , detergent≤w destabilizuj▒cych b│ony kom≤rkowe itp.) , wielokrotnego wirowania a tak┐e je╢li zachodzi potrzeba podczyszczania preparatu z bia│ek (np. denaturacja przy u┐yciu fenolu) i RNA (np. wytr▒canie octanem amonu i trawienie RNaz▒).

2. Trawienie DNA odpowiednimi restryktazami.

3. Rozdzia│ elektroforetyczny fragment≤w DNA wed│ug wielko╢ci i ich denaturacja in situ. Po rozdziale na ┐elu DNA zostaje zdenaturowany pod wp│ywem NaOH a nastΩpnie poddaje siΩ go dzia│aniu roztworu neutralizuj▒cego o pH 7,4.

4. Przeniesienie fragment≤w DNA z ┐elu na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy z zachowaniem ich charakterystycznego rozmieszczenia. Umo┐liwia to si│a ss▒ca bibu│y przy transferze kapilarnym. Mo┐liwy jest tak┐e elektrotransfer. NastΩpnie DNA zostaje zwi▒zany z filtrem przez zapiekanie w 80░C lub przez na╢wietlanie UV.

5. Hybrydyzacja z sond▒.
a. Prehybrydyzacja - polega na moczeniu filtru w odpowiednim roztworze , kt≤rego sk│adniki blokuj▒ miejsca mog▒ce zwi▒zaµ kwasy nukleinowe na filtrze. Nylon i nitroceluloza , z kt≤rych produkuje siΩ filtry maj▒ wysokie powinowactwo do jednoniciowego DNA czy RNA. Po przeniesieniu badanego materia│u jest to ju┐ cecha niekorzystna. W celu zminimalizowania t│a wynikaj▒cego z hybrydyzacji sondy do losowych cz▒steczek DNA lub RNA dodaje siΩ r≤wnie┐ niehomologiczne DNA no╢nikowe. Od tego etapu uzale┐niona jest czu│o╢µ i specyficzno╢µ eksperymentu. Eliminuje niespecyficzne t│o. Warunki prehybrydyzacji - stΩ┐enie soli , temperatura - s▒ takie same jak w│a╢ciwej hybrydyzacji.
b. W│a╢ciwa hybrydyzacja - w tym w│a╢nie etapie wyznakowana sonda wi▒┐e siΩ z unieruchomionymi na filtrze kwasami nukleinowymi. Dobranie odpowiednich warunk≤w zapewnia specyficzno╢µ czyli wi▒zanie sondy tylko z okre╢lonymi fragmentami oraz czu│o╢µ. W przypadku gdy mamy 100% lub do╢µ wysok▒ homologiΩ stosujemy ostrzejsze warunki : wy┐sz▒ temperaturΩ (65░C) , mniejsze stΩ┐enie soli , czasami dodatek formamidu. Gdy homologia jest czΩ╢ciowa , wymagane s▒ mniej ostre warunki : ni┐sza temperatura (55░C) , wy┐sze stΩ┐enie soli. SondΩ przed dodaniem nale┐y zawsze zdenaturowaµ w wysokiej temperaturze poniewa┐ musi byµ ona w postaci jednoniciowej , co umo┐liwi jej zwi▒zanie na filtrze.
c. P│ukanie filtru - pozwala na usuniΩcie niezhybrydyzowanej sondy co jest warunkiem specyficznego obrazu hybrydyzacji.

6. Ustalenie po│o┐enia fragment≤w , do kt≤rych zhybrydyzowa│a sonda z u┐yciem autoradiografii , reakcji barwnych lub fluorescencji.

R╙»NE TECHNIKI CZYLI TRZY úYKI PRAKTYKI

TECHNIKA NORTHERN

Webmaster