Pojedynczy chromosom prokariotyczny zawiera praktycznie ca│▒ informacjΩ genetyczn▒. Zdecydowana wiΩkszo╢µ bakterii ma chromosom kolisty i nie posiada b│ony oddzielaj▒cej go od cytoplazmy co daje mo┐liwo╢µ bliskiego wystΩpowania procesu produkcji mRNA na matrycy DNA oraz maszynerii odpowiedzialnej za biosyntezΩ bia│ek.

W kom≤rkach prokariotycznych procesy transkrypcji i translacji zachodz▒ jednocze╢nie do tego stopnia, ┐e mo┐liwe jest rozpoczΩcie translacji na jednym ko±cu mRNA zanim zostanie zako±czona transkrypcja na drugim ko±cu.

Kolisty chromosom bakteryjny jest podzielony na kilkadziesi▒t pΩtli, kt≤re maj▒ ko±ce unieruchomione w bia│kowym szkielecie. Bia│ka wystΩpuj▒ce w chromosomach bakteryjnych tzw. bia│ka histonopodobne, poza organizowaniem DNA w chromosomie pe│ni▒ jeszcze pewne dodatkowe funkcje przypominaj▒c dzia│aniem czynniki transkrypcyjne w kom≤rkach eukariotycznych.

Mapa chromosomu bakteryjnego daje pewne wiadomo╢ci o jego organizacji. Poza niekt≤rymi grupami gen≤w skupionymi w operony, nie da siΩ zaobserwowaµ konkretnego wzorca, wed│ug kt≤rego nastΩpowa│aby lokalizacja gen≤w w chromosomie bakteryjnym. Transkrypcja operon≤w mo┐e zachodziµ dla niekt≤rych w jednym kierunku, a dla innych w przeciwnym.

Miejsce replikacji chromosomu bakteryjnego jest ╢ci╢le okre╢lone tzw.ori (origin of replication) dla ka┐dego typu bakterii, ponadto podobna jest aran┐acja gen≤w zar≤wno w ori jak i w miejscu terminacji syntezy DNA. Poza tym w niekt≤rych bakteriach wydaje siΩ wa┐ne, aby w przypadku pewnych region≤w kierunek transkrypcji by│ taki sam jak kierunek poruszania siΩ wide│kek replikacyjnych DNA. (FIG7.33bomicroorg.)

Cz▒steczka s bierze udzia│ tylko w formowaniu pocz▒tkowego kompleksu polimerazy RNA z DNA i jest odpowiedzialna za rozpoznanie promotor≤w: sekwencji û35 od miejsca inicjacji i sekwencji Pribnow box w regionie û10 od miejsca inicjacji. W wyniku dzia│ania polimerazy RNA w kierunku 5Æ à 3Æ powstaje mRNA.

U Prokaryota pojedyncza moleku│a mRNA czΩsto koduje wiΩcej ni┐ jedno bia│ko ze wzglΩdu na wystΩpowanie grup gen≤w zwanych operonami. Polimeraza RNA transkrybuje wtedy wszystkie geny z danego operonu na pojedyncz▒ moleku│Ω mRNA (tak zwane policystroniczne mRNA). W mRNA u Prokaryota zazwyczaj nie wystΩpuj▒ introny, jednak je╢li ju┐ siΩ tam znajd▒ to s▒ samoistnie wycinane przez RNA (zwane rybozymem).

tRNA i rRNA powstaj▒ jako d│ugie cz▒steczki prekursorowe, kt≤re s▒ nastΩpnie ciΩte w kilku miejscach w celu utworzenia dojrza│ych cz▒steczek RNA. mRNA podlega na og≤│ bezpo╢redniej translacji.

Translacja zachodzi w kilku etapach : inicjacja, elongacja, terminacja, uwolnieni i sfa│dowanie polipeptydu przy wykorzystaniu ca│ej maszynerii jak▒ jest m.in. rybosom. U Prokaryota rybosomy sk│adaj▒ siΩ z dw≤ch podjednostek: 30S i 50S daj▒cych w po│▒czeniu rybosom 70S. Podjednostka 30S zawiera 16S rRNA i oko│o 21 bia│ek, natomiast podjednostka 50S zawiera 5S i 23S rRNA i oko│o 34 bia│ek.

Inicjacja syntezy bia│ek zaczyna siΩ od uformowania kompleksu zawieraj▒cego podjednostkΩ 30S, mRNA, tRNA dla formylometioniny i czynniki inicjatorowe. Do tego kompleksu przy│▒cza siΩ podjednostka 50S. Zwi▒zanie mRNA z rybosomem zale┐y od tzw. sekwencji Shine-Dalgarno (3 do 9 nukleotyd≤w zlokalizowanych przed kodonem inicjacyjnym na mRNA). Ta sekwencja jest komplementarna do 3Æ ko±ca 16S RNA rybosomu i pozwala kom≤rkom prokaryotycznym na translacjΩ policystronicznego mRNA.

Proces inicjacji rozpoczyna siΩ przy│▒czeniem aminoacylo-tRNA do kodonu start. U bakterii inicjatorowym aminoacylo-tRNA jest formylometionina. Terminacja syntezy bia│ek zachodzi gdy osi▒gniΩty zostanie kodon nonsensowny inaczej zwany kodonem stop. Bia│ka uwalniaj▒ siΩ, a rybosom dysocjuje na dwie podjednostki.

Zgromadzenie powi▒zanych ze sob▒ funkcyjnie gen≤w bakteryjnych w jednym miejscu zwi▒zane jest z regulacj▒ przeprowadzan▒ przez specyficzne cz▒steczki, umo┐liwiaj▒c▒ kontrolΩ ekspresji gen≤w jednego szlaku metabolicznego.

Tego typu regulacja ekspresji gen≤w bakteryjnych bierze siΩ z konieczno╢ci efektywnego wykorzystania ograniczonych zapas≤w i energii oraz produkcji wy│▒cznie niezbΩdnych zwi▒zk≤w.

Prawid│owo funkcjonuj▒ca kom≤rka bakteryjna nie powinna syntetyzowaµ enzym≤w do metabolizmu laktozy, je┐eli brak jest laktozy w po┐ywce. Podobnie bezsensowne by│oby produkowanie enzym≤w do syntezy tryptofanu je╢li znajdowa│by siΩ on w wystarczaj▒cej ilo╢ci.

Dlatego te┐ kom≤rki bakteryjne opracowa│y precyzyjne mechanizmy kontroli syntezy r≤┐nych zwi▒zk≤w oparte na strukturze ich informacji genetycznej, w kt≤rej geny odpowiedzialne za konkretny szlak metaboliczny znajduj▒ siΩ w jednym miejscu i tworz▒ tzw. operon.

Pierwszym poznanym mechanizmem regulacji operonowej u bakterii jest proces rozk│adu laktozy u E.coli. Laktoza jest disacharydem ulegaj▒cym roz│o┐eniu na dwa cukry sk│adowe: galaktozΩ i glukozΩ, pod wp│ywem enzymu beta-galaktozydazy. Je╢li w ╢rodowisku nie ma laktozy, w kom≤rce E.coli znajduje siΩ tylko kilka cz▒steczek tego enzymu. Natomiast w momencie gdy w ╢rodowisku znajduje siΩ laktoza, w kom≤rce pojawiaj▒ siΩ tysi▒ce cz▒steczek beta-galaktozydazy. Dodatkowo zwiΩksza siΩ w kom≤rce ilo╢µ pozosta│ych enzym≤w zaanga┐owanych w szlak laktozowy (galaktozydopermeazy i transacetylazy galaktozydowej). Ka┐dy z tych enzym≤w jest kodowany przez oddzielny gen jednak ich ekspresja ulega wsp≤lnej regulacji. Geny tych trzech enzym≤w znajduj▒ siΩ w jednym liniowym odcinku na chromosomie E.coli i zosta│y oznaczone wed│ug kolejno╢ci wystΩpowania:

• Z - beta galaktozydaza
• Y - beta galaktozydopermeaza (bia│ko transportowe)
• A - transacetylaza galaktozydowa.

Ekspresja wszystkich trzech gen≤w podlegaµ mo┐e jednoczesnej indukcji przez cz▒steczkΩ laktozy. Na tej podstawie stwierdzono, ┐e przed tymi genami musi siΩ znajdowaµ niezale┐ny element genetyczny, kt≤ry reguluje ich ekspresjΩ.

W ko±cu okaza│o siΩ, ┐e w regulacji bierze udzia│ kilka gen≤w:

• gen regulatorowy (gen lacI), kt≤ry koduje cz▒steczkΩ represora zdoln▒ do przej╢cia w inne miejsce, do operatora, gdzie indukuje ona sygna│ wy│▒czaj▒cy operon
• gen operatora, kt≤ry otrzymuje sygna│ wy│▒czaj▒cy z represora
• trzy geny koduj▒ce bia│ka, kt≤re s▒ transkrybowane na jedno mRNA
• miejsce promotora (czΩ╢ciowo nachodz▒ce na gen operatorowy), gdzie przy│▒cza siΩ RNA polimeraza i indukuje syntezΩ mRNA

Operon laktozowy, lac, dzia│a w nastΩpuj▒cy spos≤b. Gen regulatorowy produkuje cz▒steczkΩ represora, kt≤ra mo┐e przenie╢µ siΩ do miejsca wystΩpowania operatora, przy│▒czyµ siΩ do niego i zahamowaµ transkrypcjΩ gen≤w strukturalnych w tym operonie.

Je┐eli w pobli┐u nie ma cz▒steczek laktozy, cz▒steczka represora przyjmuje konformacjΩ zdoln▒ do zwi▒zania siΩ z operatorem. Gdy represor zwi▒┐e siΩ z operatorem, promotor jest czΩ╢ciowo zas│oniΩty, wobec czego polimeraza RNA nie mo┐e siΩ z nim zwi▒zaµ i nie dochodzi do transkrypcji mRNA a nastΩpnie syntezy trzech bia│ek.

Je┐eli natomiast w ╢rodowisku obecna jest laktoza, represor wi▒┐e siΩ z ni▒ i przyjmuje inny kszta│t, kt≤ry nie pozwala na po│▒czenie siΩ z operatorem. Promotor pozostaje ods│oniΩty, wi▒┐e siΩ z polimeraz▒ RNA i dochodzi do ekspresji gen≤w, kt≤re nastΩpnie prowadz▒ do rozk│adu laktozy.

Jest to przyk│ad regulacji gen≤w na poziomie transkrypcyjnym.

FIG 14-10 z Hopsona p. 314 An inducible operon

Ten mechanizm jest prosty i │adnie t│umaczy dlaczego kom≤rka E.coli produkuje tylko tyle beta-galaktozydazy ile jest jej potrzebne. Jednak w rzeczywisto╢ci sytuacja staje siΩ nieco bardziej skomplikowana gdy┐ kom≤rka bakterii mo┐e jednocze╢nie otrzymaµ laktozΩ i glukozΩ. Co wtedy?

Dla bakterii korzystniejsze jest roz│o┐enie glukozy ni┐ laktozy, poniewa┐ glukoza mo┐e byµ natychmiast zu┐yta w metabolizmie, a laktoza musi zostaµ najpierw roz│o┐ona w skomplikowanych reakcjach chemicznych.

Bakteria zdolna do zu┐ycia glukozy pomimo obecno╢ci laktozy w po┐ywce bΩdzie ros│a szybciej ni┐ inne bakterie tym samym zdobywaj▒c pewn▒ nad nimi przewagΩ.

Dlatego te┐ nie nale┐y siΩ dziwiµ, ┐e powsta│ mechanizm tzw. represja kataboliczna, kt≤ry umo┐liwia bakterii zu┐ywanie na pocz▒tku glukozy nawet gdy jest laktoza. Mechanizm represji katabolicznej opiera siΩ na fakcie, ┐e polimeraza RNA │▒czy siΩ z promotorem w operonie lac du┐o lepiej w obecno╢ci specyficznego bia│ka CAP (catabolite gene activator protein), kt≤re musi byµ zwi▒zane ze specyficznym miejscem DNA po│o┐onym w pobli┐u tzw.CBS (CAP binding site). Bia│ko CAP wi▒┐e siΩ z tym miejscem je╢li do tego bia│ka przy│▒cz▒ siΩ cz▒steczki cAMP, co zachodzi przy braku glukozy.

Je┐eli natomiast glukoza znajduje siΩ w po┐ywce, spada poziom cAMP, bia│ko CAP zmienia kszta│t, nie wi▒┐e siΩ z CBS, polimeraza RNA gorzej wi▒┐e siΩ z promotorem i synteza enzym≤w szlaku laktozowego zostaje spowolniona.

Fig14-11 p.315 Represja kataboliczna Biology Wessels Hopson

Istniej▒ wiΩc trzy r≤┐ne poziomy aktywno╢ci operonu lac, zale┐ne od obecno╢ci laktozy i glukozy w po┐ywce oraz regulowane przez trzy r≤┐ne bia│ka: lac represor, polimerazΩ RNA i CAP.

Najni┐szy poziom ekspresji zachodzi pod nieobecno╢µ laktozy: nie ma substratu, niepotrzebne s▒ enzymy do katalizy, represor lac jest po│▒czony z operonem i blokuje wi▒zanie siΩ polimerazy RNA.

Najwy┐szy poziom ekspresji obserwuje siΩ przy obecno╢ci laktozy, lecz braku glukozy: laktoza wi▒┐e represor uniemo┐liwiaj▒c mu zwi▒zanie siΩ z operatorem, co z kolei pozwala na przy│▒czenie polimerazy RNA, a dodatkowo wysoki poziom cAMP i │▒czenie siΩ go z CAP i CAP z CBS co w rezultacie uaktywnia polimerazΩ RNA.

Model regulacji rozk│adu laktozy w operonie lac jest jednym z wielu jakie funkcjonuj▒ w kom≤rkach bakteryjnych. Jest to przyk│ad pozytywnej regulacji ekspresji gdy┐ obecno╢µ substratu w po┐ywce indukuje produkcjΩ enzym≤w.

Ponadto mamy do czynienia z innymi modelami regulacji ekspresji gen≤w r≤wnie┐ wynikaj▒cymi z d▒┐enia kom≤rki do efektywnego wykorzystania surowc≤w ale jednocze╢nie nie nadprodukowania jakiej╢ substancji bez wyra╝nej potrzeby. Ten typ mechanizmu regulacji to represja czyli zahamowanie syntezy enzym≤w szlaku biosyntetycznego w odpowiedzi na nadmiar ko±cowego produktu. Przyk│adem operonu regulowanego w ten spos≤b jest operon tryptofanowy (trp).

Operon ten zawiera piΩµ gen≤w (E,D,C,B,A) koduj▒cych enzymy, kt≤re prowadz▒ do syntezy aminokwasu - tryptofanu. W przypadku operonu tryptofanowego r≤wnie┐ mamy do czynienia z cz▒steczk▒ represora kodowan▒ w niewielkiej odleg│o╢ci od operonu. Cz▒steczka represora trp podobnie jak lac mo┐e istnieµ w dw≤ch konformacjach: jedna powoduje │▒czenie z operatorem i zablokowanie transkrypcji, natomiast druga konformacja nie pozwala na zwi▒zanie siΩ represora z operatorem i umo┐liwia zaj╢cie transkrypcji.

W obecno╢ci tryptofanu cz▒steczka represora wi▒┐e siΩ z tym aminokwasem i zmienia konformacjΩ, na tak▒ kt≤ra umo┐liwia zwi▒zanie siΩ z operatorem i zablokowanie syntezy enzym≤w.

Je┐eli tryptofan jest nieobecny, represor nie mo┐e zwi▒zaµ siΩ z operatorem. Dochodzi wtedy do przy│▒czenia polimerazy RNA i syntezy enzym≤w, kt≤re w nastΩpstwie doprowadz▒ do syntezy tryptofanu.

Oba opisane mechanizmy regulacji ekspresji gen≤w czyli indukcja operonu lac i represja operonu trp s▒ przyk│adami na kontrolΩ negatywn▒. Oznacza to, ┐e ekspresja gen≤w podlegaj▒cych takiej kontroli zachodzi dop≤ki nie zostanie wy│▒czona przez cz▒steczkΩ represora.

Istnieje jeszcze model pozytywnej regulacji ekspresji gen≤w, co z kolei oznacza, ┐e geny znajduj▒ce siΩ pod tak▒ kontrol▒ ulegaj▒ ekspresji dopiero pod wp│ywem dzia│ania specyficznego bia│ka regulatorowego. Przyk│adem tego typu regulacji mo┐e byµ opisana ju┐ wcze╢niej aktywacja kompleksu promotor-polimeraza RNA operonu lac przez wi▒z▒nie siΩ bia│ka CAP do CBS.

Innym przyk│adem regulacji pozytywnej jest katabolizm maltozy u E.coli. Enzymy do rozk│adu maltozy s▒ syntetyzowane dopiero po dodaniu maltozy do po┐ywki. Ich synteza jest regulowana na poziomie transkrypcji przez bia│ko aktywuj▒ce (AP-activator protein). AP nie mo┐e zwi▒zaµ siΩ z DNA dop≤ki nie po│▒czy siΩ z cz▒steczk▒ maltozy. Gdy AP zwi▒┐e siΩ z cz▒steczk▒ maltozy, kompleks taki │▒czy siΩ z DNA i umo┐liwia polimerazie RNA rozpoczΩcie transkrypcji. Aktywator podobnie jak represor rozpoznaje specyficzn▒ sekwencjΩ DNA tzw. miejsce wi▒zania aktywatora. Geny potrzebne do katabolizmu maltozy znajduj▒ siΩ w kilku operonach wobec czego aktywator kontroluje wiΩcej ni┐ jeden operon. Grupa operon≤w regulowanych przez jedno bia│ko aktywuj▒ce nazywana jest regulonem.

Atenuacja jest typem regulacji opartym na fakcie, ┐e w organizmach prokariotycznych transkrypcja i translacja s▒ procesami wzajemnie po│▒czonymi. Atenuacja zosta│a zaobserwowana w niekt≤rych operonach kontroluj▒cych biosyntezΩ aminokwas≤w.

Najlepiej zbadanym przyk│adem jest atenuacja w operonie tryptofanowym. Poza wspomnianymi ju┐ wcze╢niej genami i strukturami znajduj▒cymi siΩ w tym operonie, operon ten zawiera tzw. sekwencjΩ liderow▒ w obrΩbie kt≤rej znajduje siΩ region atenuatora koduj▒cy polipeptyd zawieraj▒cy przy ko±cu kodony tryptofanu. Je┐eli w kom≤rce znajduje siΩ du┐o tryptofanu peptyd liderowy zostanie zsyntetyzowany. Natomiast przy braku tryptofanu nie powstanie peptyd liderowy. Jakie s▒ tego rezultaty?

Synteza peptydu liderowego prowadzi do zahamowania transkrypcji gen≤w tryptofanowych. W jaki spos≤b?

Proces ten jest mo┐liwy ze wzglΩdu na fakt, ┐e transkrypcja i translacja w kom≤rkach bakterii zachodzi praktycznie jednocze╢nie. Sekwencja liderowa jako pierwsza ulega transkrypcji i gdy nastΩpnie transkrypcja idzie dalej, mRNA sekwencji liderowej ulega ju┐ translacji. Jednak┐e w przypadku mRNA sekwencji liderowej, gdy jest ju┐ uwolnione z DNA i po│▒czy siΩ z rybosomem ulega ono sfa│dowaniu w podw≤jn▒ pΩtlΩ, kt≤ra sygnalizuje zatrzymanie transkrypcji dalszych gen≤w (tryptofanowych).

Je╢li nie ma tryptofanu to nie dojdzie do translacji ca│ej sekwencji liderowej gdy┐ zostanie ona zatrzymana na kodonie tryptofanowym, co powoduje przyjΩcie innej konformacji przez mRNA sekwencji liderowej. Ta konformacja nie blokuje polimerazy RNA, kt≤ra przechodzi dalej do transkrypcji gen≤w tryptofanowych. Mechanizmy represji i atenuacji operonu tryptofannowego w precyzyjny spos≤b kontroluj▒ syntezΩ enzym≤w szlaku biosyntezy tryptofanu.

Podobne modele atenuacji odkryto w innych szlakach metabolicznych bekterii np. w biosyntezie histydyny czy fenyloalaniny.

WiΩkszo╢µ system≤w kontroluj▒cych czy to transkrypcjΩ czy translacjΩ wykorzystuje bia│ka jako cz▒steczki regulatorowe. Jednak niekiedy zdarza siΩ, ┐e w regulacjΩ zostanie zaanga┐owane RNA.

Jednym z rodzaj≤w regulatorowego RNA jest RNA antysensowne u┐ywane w kontroli r≤┐nych gen≤w bakteryjnych. Antysensowne RNA oddzia│uje jako regulator poprzez parowanie z komplementarn▒, sensown▒ nici▒ RNA. Je┐eli t▒ komplementarn▒ nici▒ jest mRNA, to parowanie z antysensownym RNA mo┐e zapobiec zaj╢ciu translacji.

Antysensowne RNA mo┐e byµ syntetyzowane z tego samego genu co mRNA przez zastosowanie drugiego promotora zorientowanego w przeciwnym kierunku do pierwszego lub poprzez drugi gen z promotorem na przeciwnym ko±cu.

Plazmidy s▒ to elementy genetyczne zdolne do autonomicznego powielania siΩ i istnienia pozachromosomalnego. WiΩkszo╢µ plazmid≤w ma koliste, superzwiniΩte dsDNA, a niekt≤re liniowe dsDNA. Wiele plazmid≤w mo┐e byµ przenoszonych w procesie koniugacji z jednej do drugiej kom≤rki. Niekt≤re plazmidy maj▒ zdolno╢µ do wintegrowywania siΩ w chromosom bakteryjny i wtedy ich replikacja podlega kontroli bakterii.

W genomie wirusa kodowane s▒ niekt≤re enzymy niezbΩdne do jego replikacji jednak reszta czyli: systemy zapewniaj▒ce energiΩ, rybosomy, tRNA (z pewnymi wyj▒tkami) oraz enzymy aktywuj▒ce aminokwasy s▒ dostarczane przez kom≤rkΩ gospodarza.

FIG 6-9 p 194.

(Powy┐ej opisany proces dotyczy wirus≤w bakteryjnych).

Pierwszy etap replikacji wirusa charakteryzuje siΩ du┐▒ specyficzno╢ci▒ interakcji pomiΩdzy wirusem a gospodarzem. Cz▒steczka wirusa posiada na swojej powierzchni bia│ka, kt≤re oddzia│uj▒ ze specyficznymi elementami powierzchniowymi na kom≤rce zwanymi receptorami. Zwykle pe│ni▒ one w kom≤rce normalne funkcje np. bia│ka transportowe czy bia│ka otoczki bakteryjnej lub w przypadku grypy jest to glikoproteina na erytrocytach.

Je╢li receptor nie wystΩpuje lub jest zmieniony, wirus nie mo┐e adsorbowaµ i infekcja nie zajdzie - gospodarz staje siΩ odporny na wirusa, oczywi╢cie dop≤ki w wirusie nie zajdzie mutacja umo┐liwiaj▒ca mu adsorpcjΩ do zmutowanego receptora.

Przy│▒czanie siΩ wirusa mo┐e zachodziµ r≤wnie┐ na niespecyficznej drodze poprzez fagocytozΩ lub inne procesy endocytozy (powszechne w╢r≤d wirus≤w zwierzΩcych i ro╢linnych).

Proces penetracji wirusa do wewn▒trz kom≤rki gospodarza zale┐ny jest od charakteru tej kom≤rki, szczeg≤lnie od jej struktur powierzchniowych w wyniku czego penetracja zachodzi inaczej w kom≤rkach zwierzΩcych pozbawionych ╢ciany kom≤rkowej ni┐ w ro╢linnych i bakteryjnych.

Przyk│adem skomplikowanego mechanizmu penetracji jest infekcja kom≤rki E.coli bakteriofagiem T4 (FIG 6.11) Wirion T4 posiada strukturΩ g│owow▒, osadzon▒ na ogonku, kt≤ry ko±czy siΩ zestawem w│≤kien ogonowych. W│≤kna te jako pierwsze przy│▒czaj▒ siΩ do powierzchni kom≤rki a nastΩpnie obkurczaj▒ co powoduje zbli┐enie siΩ rdzenia ogonka do powierzchni kom≤rki. Enzym wirusowy o charakterze lizozymu powoduje powstanie niewielkiego otworu w ╢cianie kom≤rkowej, przez kt≤ry wnika DNA wirusowe.

Na tym etapie istnieje jeszcze mo┐liwo╢µ usuniΩcia kwasu nukleinowego wirusa poprzez dzia│anie enzym≤w restrykcyjnych znajduj▒cych siΩ na terenie kom≤rki. Jednak┐e wirusy "nauczy│y siΩ" przeciwdzia│aµ temu procesowi; modyfikuj▒c kwasy nukleinowe w podobny spos≤b jak kom≤rki gospodarza lub hamuj▒c dzia│anie system≤w restrykcyjnych przez specyficzne bia│ka.

W celu powstania nowych bia│ek wirusowych musz▒ zostaµ utworzone specyficzne mRNA. Synteza mRNA wirusowego zale┐y od typu wirusa i jego materia│u genetycznego. FIG6.12 p196.

W przypadku gdy informacjΩ genetyczn▒ wirusa stanowi RNA mo┐liwe jest kilka rozwi▒za± dla produkcji mRNA. Gdy mamy do czynienia z wirusem zawieraj▒cym jednoniciowe RNA pozytywne (+), oznacza to, ┐e s│u┐y ono bezpo╢rednio jako mRNA. W tym RNA kodowana jest miΩdzy innymi polimeraza RNA specyficzna dla wirusa. Polimeraza ta pocz▒tkowo powoduje powstanie negatywnej nici komplementarnej, kt≤ra nastΩpnie s│u┐y jako matryca do wytworzania wiΩkszej ilo╢ci nici pozytywnych.

Je╢li natomiast wyj╢ciowym materia│em genetycznym jest jednoniciowe RNA negatywne (-) lub dwuniciowe RNA sytuacja siΩ nieco komplikuje, gdy┐ nie mo┐e ono pe│niµ bezpo╢rednio funkcji mRNA. Aby powsta│o mRNA konieczna jest RNA-zale┐na polimeraza RNA, kt≤ra wystΩpuje w wirusach i prowadzi do syntezy mRNA.

Retrowirusy (wirusy RNA) replikuj▒ siΩ dziΩki po╢rednictwu DNA. Proces kopiowania informacji genetycznej z RNA na DNA jest to odwrotna transkrypcja i zachodzi on pod wp│ywem enzymu tzw. odwrotnej transkryptazy. Po zainfekowaniu kom≤rki, RNA wirionu kopiowane jest na dwuniciowe DNA (dsDNA) z przej╢ciem przez etap ssDNA. NastΩpnie dsDNA s│u┐y jako matryca do syntezy mRNA.

Gdy mamy ju┐ mRNA mo┐liwa jest synteza bia│ek wirusowych. Bia│ka te nale┐▒ do trzech g│≤wnych grup:

• wczesne bia│ka o charakterze enzymatycznym, niezbΩdne do replikacji kwasu nukleinowego wirusa, syntetyzowane w niewielkich ilo╢ciach
• p≤╝ne bia│ka czyli m.in. bia│ka p│aszcza wirusowego, bia│ka strukturalne, syntetyzowane w du┐ych ilo╢ciach
• bia│ka lityczne, kt≤re umo┐liwiaj▒ otworzenie kom≤rki gospodarza i uwolnienie cz▒steczek wirusa.

Istnieje ogromna liczba wirus≤w bakteryjnych, wiele z nich ma skomplikowan▒ strukturΩ, tylko niekt≤re posiadaj▒ lipidow▒ otoczkΩ. WiΩkszo╢µ badanych wirus≤w atakuje E.coli lub Salmonella typhimurium.

Bakteriofagi RNA

Najlepiej poznane bakteriofagi RN-owe zawieraj▒ jednoniciowe RNA. U Enterobacteriaceae bakteriofagi infekuj▒ tylko kom≤rki odgrywaj▒ce rolΩ donor≤w w procesie rekombinacji genetycznej co zwi▒zane jest z wystΩpowaniem na tych kom≤rkach specyficznech pili, bΩd▒cych jednocze╢nie receptorami dla cz▒steczek tych wirus≤w.

Bakteriofagi te, s▒ niewielkie (ok. 26 nm) i maj▒ symetriΩ ikosaedraln▒. Niekt≤re genomy tych bakteriofag≤w zosta│y ju┐ poznane np. MS2 ma genom o d│ugo╢ci 3569 nukleotyd≤w, niµ RNA (+), kt≤ra dzia│a bezpo╢rednio jako mRNA. W kom≤rce gospodarza mRNA wchodzi do rybosomu i produkowane s▒ cztery typy bia│ek; dojrza│o╢ci, odpowiedzialne za lizΩ, strukturalne do budowy p│aszcza oraz replikaza RNA (kombinacja polipeptyd≤w wirusa i gospodarza). Ciekawostk▒ jest, ┐e gen bia│ka odpowiedzialnego za lizΩ kom≤rki gospodarza nachodzi zar≤wno na gen bia│ka p│aszczowego jak i na gen replikazy, co w rezultacie powoduje, ┐e rozpoczΩcie translacji tego genu jest niemo┐liwe dop≤ki nie powstanie odpowiednia ilo╢µ bia│ka p│aszczowego.

Bakteriofagi ssDNA maj▒ genom w formie zamkniΩtego ko│a o ╢rednicy ok. 25 nm, p│aszcz zbudowany z pojedynczego bia│ka w 60 kopiach, do kt≤rego do│▒czone s▒ inne bia│ka tworz▒ce strukturΩ szpikulcopodobn▒.

Bakteriofagi te, w przeciwie±stwie do poprzednich, podczas replikacji korzystaj▒ g│≤wnie z maszynerii kom≤rkowej i posiadaj▒ we w│asnym genomie jedynie podstawowe informacje dotycz▒ce bia│ek kapsydowych, szpikulcowych czy powoduj▒cych lizΩ kom≤rki bakteryjnej.

Najpowszechniej badany wirus z tej grupy to f X174, atakuj▒cy E.coli, w kt≤rym po raz pierwszy odkryto geny nachodz▒ce na siebie (ang. overlapping genes). Geny te stanowi▒ rozwi▒zanie problemu ma│ej ilo╢ci DNA koduj▒cego, pozwalaj▒c na bardziej efektywne wykorzystanie informacji genetycznej, ale jednocze╢nie stwarzaj▒ niebezpiecze±stwo, ┐e jedna mutacja mo┐e wp│yn▒µ na dwa geny.

FIG 6.17

Replikacja tego wirusa zachodzi wed│ug modelu obracaj▒cego siΩ ko│a (rolling circle replication). Najpierw jednak dochodzi do powstania RF, czyli replikacyjnej formy DNA. Jest to superzwiniΩte dsDNA, kt≤re powstaje wskutek dzia│ania kom≤rkowych enzym≤w na ssDNA wirusa.

NastΩpne RF tworzone s▒ w konwencjonalny spos≤b poprzez semikonserwatywn▒ replikacjΩ z po╢rednimi formami theta, ale utworzenie genomu ssDNA zachodzi wed│ug wspomnianego wy┐ej modelu. FIG 6-18.

Jedna niµ zostaje przerwana i koniec 3' u┐ywany jest do rozpoczΩcia syntezy nowej nici. Synteza ta jest asymetryczna poniewa┐ tylko jedna z nici jest matryc▒. Gdy zostanie osi▒gniΩta odpowiednia d│ugo╢µ odpowiedni enzym przecina i │▒czy dwa ko±ce nowej nici.

Wiele wirus≤w zawiera materia│ genetyczny w postaci podw≤jnej nici DNA (dsDNA). By│y to pierwsze odkryte wirusy bakteryjne i s▒ one bardzo intensywnie badane.

Bakteriofag T7 jest wirusem atakuj▒cym E.coli, posiada ikosaedraln▒ g│≤wkΩ i ma│y ogonek. Jego genom zosta│ zsekwencjonowany i zbadany. Okaza│o siΩ, ┐e czΩ╢µ gen≤w nachodzi na siebie i ich kolejno╢µ wp│ywa na regulacjΩ powielania wirusa.

DNA wirusowe wchodzi liniowo do kom≤rki gospodarza, zaczynaj▒c od lewego ko±ca i nastΩpuje natychmiastowa transkrypcja kilku gen≤w na tym ko±cu dziΩki kom≤rkowej RNA polimerazie.

Powstaj▒ nachodz▒ce na siebie policystroniczne mRNA, kt≤re zostaj▒ przeciΩte przez kom≤rkow▒ RnazΩ, daj▒c mniejsze mRNA koduj▒ce: bia│ka hamuj▒ce system restrykcyjny gospodarza oraz wirusow▒ RNA polimerazΩ, a tak┐e bia│ka hamuj▒ce RNA polimerazΩ kom≤rki gospodarza.

Gdy zostaje zahamowana polimeraza kom≤rki bakteryjnej (kontrola negatywna), zako±czona jest transkrypcja wczesnych gen≤w T7. Natomiast fagowa polimeraza rozpoznaje tylko pozosta│e promotory na genomie T7 prowadz▒c do syntezy reszty bia│ek faga.

Replikacja DNA zaczyna siΩ w ori sk▒d odbywa siΩ w obu kierunkach jednocze╢nie, przy zastosowaniu dw≤ch typ≤w primer≤w RNA ; w lewo primer syntetyzowany przez primazΩ T7, w prawo syntetyzowany przez T7 RNA polimerazΩ. Oba primery podlegaj▒ wyd│u┐aniu przez fagow▒ polimerazΩ DNA. FIG6.21

Wirus T7 posiada pewn▒ cechΩ strukturaln▒ tzw. dtr (direct terminal repeat o d│ugo╢ci ok.160bp, na 5Æ ko±cach cz▒steczki) przydatn▒ podczas replikacji. W celu zako±czenia replikacji na 5Æ ko±cu DNA primery RNA musz▒ zostaµ usuniΩte. Na obu ko±cach DNA faga T7 zostaj▒ pewne fragmenty, kt≤re nie uleg│y replikacji. T7 ôrozwi▒zujeö ten problem przy u┐yciu wspominanych ju┐ sekwencji dtr. Na obu niciach 3Æ DNA znajduj▒ siΩ sekwencje komplementarne do dtr i │▒cz▒ siΩ z nimi tworz▒c cz▒steczkΩ o podwojonej d│ugo╢ci w por≤wnaniu do normalnego T7. Niezreplikowane do tej pory fragmenty DNA zostaj▒ uzupe│nione dziΩki dzia│aniu polimerazy i ligazy DNA co prowadzi do utworzenia tzw. konkatameru. Konkatamer zostaje pociΩty na cz▒steczki o d│ugo╢ci odpowiadaj▒cej wirusowi T7 przez specjalny enzym.

NajwiΩksze i najbardziej skomplikowane fagi zar≤wno pod wzglΩdem struktury jak i replikacji nale┐▒ do tzw. grupy fag≤w T-parzystych.

Przyk│adowym fagiem z tej grupy jest T4, maj▒cy ikosaedraln▒ g│≤wkΩ wyd│u┐on▒ przez dodatkowe bia│ka oraz zr≤┐nicowany strukturalnie ogonek. W genomie T4 znajduje siΩ nietypowy nukleotyd 5-hydroksymetylocytozyna (dodatkowo glukozylowany) zamiast cytozyny, kt≤ry powoduje ┐e dane DNA jest odporne na restrykcyjne endonukleazy bakteryjne. DNA T4 wystΩpuje w formie liniowej jednak jego mapa genetyczna przedstawiana jest w formie ko│owej.

Proces replikacji DNA T4 jest podobny do T7 jednak┐e enzym tn▒cy DNA na jednakowe fragmenty liniowe nie jest specyficzny do sekwencji co powoduje powstawanie zr≤┐nicowanych ko±cow cz▒steczki i nieco d│u┐szych genom≤w wirusowych.

Geny fagaT4 koduj▒ dwie podstawowe grupy bia│ek; wczesne, czyli enzymy zaanga┐owane w proces replikacji i transkrypcji, oraz p≤╝ne czyli bia│ka strukturalne g│≤wki i ogonka, a tak┐e enzymy uwalniaj▒ce faga z kom≤rki. Fag T4 korzysta w trakcie syntezy z polimerazy RNA wystΩpuj▒cej w kom≤rce bakteryjnej. Formowanie g│≤wki i ogonka zachodzi niezale┐nie, DNA zostaje upakowane w g│≤wce nastepnie przy│▒cza siΩ ogonek i fag gotowy jest do opuszczenia kom≤rki. Liza ╢ciany kom≤rkowej bakterii zachodzi pod wp│ywem lizozymu, kt≤ry atakuje peptydoglikany kom≤rkowe. Ca│y proces mo┐e trwaµ oko│o 25 minut.fig6.24

WiΩkszo╢µ wirus≤w bakteryjnych przechodzi cykl lityczny prowadz▒cy do zabicia kom≤rki bakteryjnej. Jednak┐e jest wiele wirus≤w, kt≤re pomimo mo┐liwo╢ci zabicia kom≤rki wybieraj▒ drogΩ lizogeniczn▒ czyli │agodn▒ kiedy to wiΩkszo╢µ gen≤w faga nie ulega ekspresjii a genom fagowy wbudowany do bakteryjnego ulega synchronicznej replikacji i wraz z podzia│ami kom≤rkowymi jest przekazywany nastΩpnym pokoleniom bakterii. FIG 6.25 koniecznie Bakteria zainfekowana wirusem w │agodnej postaci jest odporna na nastΩpne ataki nowych cz▒steczek tego wirusa.

Wirusy │agodne istniej▒ w kom≤rkach zazwyczaj w formie zwanej prowirusem. Prowirus posiada tak▒ sam▒ informacjΩ genetyczn▒ jak wirus. Jednak jest ona zablokowana przez specjalny fagowy represor i nie ulega ekspresji. Ta sytuacja mo┐e ulec zmianie pod wp│ywem specyficznych czynnik≤w (np.UV, promieniowanieX) powoduj▒cych inaktywacjΩ represora - indukcja lizogeniczna.

Wirus │agodny mo┐e istnieµ w dw≤ch formach zale┐nych od warunk≤w. Czasem jako niezale┐na jednostka, kontroluj▒ca swoj▒ replikacjΩ (cykl lityczny), lub jako DNA wintegrowane w materia│ genetyczny kom≤rki gospodarza (cykl │agodny - lizogeniczny).

Najlepiej poznanym wirusem │agodnym jest lambda atakuj▒ca E.coli, zawiera on dsDNA w formie liniowej z 12-nukleotydowymi jednoniciowymi, komplementarnymi ogonami na 5' ko±cach, kt≤re │▒cz▒ sie formuj▒c dwuniciow▒ kolist▒ cz▒steczkΩ.

Genom faga lambda zawiera dwa zestawy gen≤w; jeden - kontroluj▒cy cykl lityczny, drugi - lizogeniczny. Podczas infekcji dochodzi do zapocz▒tkowania ekspresji gen≤w obu cykli. Fag lambda zawiera kilka operon≤w.

Po wprowadzeniu wirusa do kom≤rki zapocz▒tkowana zostaje transkrypcja jego gen≤w. Produktem genu cI jest bia│ko cI bΩd▒ce represorem transkrypcji gen≤w zaanga┐owanych w cykl lityczny. Je╢li represor zgromadzi siΩ w kom≤rce zanim ulegn▒ ekspresji geny lityczne to zahamuje on cykl lityczny.

Powodem dla kt≤rego liza nie zawsze zostaje zahamowana jest istnienie bia│ka Cro bΩd▒cego produktem genu cro. Kluczem do zrozumienia tego procesu jest po│o┐enie gen≤w koduj▒cych te dwa bia│ka. Te dwa geny le┐▒ blisko siebie, s▒ transkrybowane w przeciwnych kierunkach a pomiΩdzy nimi znajduj▒ siΩ promotory i operatory do kt≤rych mog▒ siΩ wi▒zaµ produkty obu gen≤w. Gdy represor lambda jest zwi▒zany ze swoim operatorem, zas│ania on promotor cro. Natomiast gdy bia│ko Cro jest zwi▒zane ze swoim operatorem zas│ania ono jeden z promotor≤w dla cI.

W cyklu lizogenicznym nastΩpuje ci▒g│a ekspresja genu cI. Produkt czyli represor wi▒┐e siΩ z dwoma operatorami na DNA i wy│▒cza transkrypcjΩ reszty gen≤w faga lambda (kontrola negatywna), jednocze╢nie indukuje syntezΩ samego siebie (kontrola pozytywna). W ten spos≤b represor zapewnia zahamowanie ekspresji innych gen≤w koniecznych do wzrostu i reprodukcji faga.

W kom≤rce lizogenicznej powielenie faga mo┐e zaj╢µ tylko w przypadku inaktywacji represora, co jest mo┐liwe przy zastosowaniu czynnik≤w niszcz▒cych DNA. Jednym z rezultat≤w dzia│ania takich czynnik≤w jest zmiana bia│ka RecA ( w normalnych warunkach bior▒cego udzia│ w rekombinacji genetycznej) w specyficzn▒ proteazΩ, kt≤ra bierze udzia│ w zniszczeniu represora. W momencie gdy represor jest zdezaktywowany, mo┐e ju┐ zachodziµ transkrypcja pozosta│ych gen≤w faga lambda do tej pory zablokowanych, co w rezultacie prowadzi do lizy kom≤rki.

FIG 6.25, 27

DNA faga lambda integruje w chromosom gospodarza w postaci kolistej w specyficznym miejscu na chromosomie tzw.att (bacterial attachment sites) dziΩki enzymowi integrazie (kodowanym przez fagowy gen int).

Podczas wzrostu kom≤rki system represji faga lambda uniemo┐liwia zaj╢cie lizy kom≤rki, natomiast w trakcie replikacji DNA gospodarza zachodzi r≤wnoczesna replikacja DNA faga i w kom≤rce potomnej dochodzi do uruchomienia cyklu produktywnego.

Fag lambda u┐ywany jest jako wektor w in┐ynierii genetycznej, do konstruowania hybryd DNA z enzymami restrykcyjnymi. Fag lambda zawiera d│ugi region DNA, kt≤ry dziΩki temu, ┐e nie pe│nie ┐adnych istotnych funkcji w replikacji mo┐e byµ zastΩpowany obcym DNA.

Bakteriofag Mu jest jednym z bardziej interesuj▒cych fag≤w ze wzglΩdu na jego mo┐liwo╢µ replikacji jako ruchomego elementu genetycznego. Mu jest wyj▒tkowo mutagenny, poniewa┐ mo┐e integrowaµ w ╢rodku genu kom≤rki gospodarza inaktywuj▒c go, ponadto ma zdolno╢µ do przemieszczania siΩ w genomie.

Wirusy zwierzΩce posiadaj▒ materia│ geneyczny zar≤wno w formie RNA jak i DNA. Jedn▒ z wa┐niejszych grup wirus≤w zwierzΩcych s▒ retrowirusy, gdy┐ powoduj▒ one choroby bardzo gro╝ne dla cz│owieka (AIDS). Wirusy dzieli siΩ na r≤┐ne grupy w zale┐no╢ci od typu kwasu nukleinowego, obecno╢ci otoczki i niekiedy wed│ug stosowanego modelu replikacyjnego.

FIG6.35

Wirusowa infekcja kom≤rki zwierzΩcej mo┐e mieµ ro┐ne efekty. Wirus mo┐e spowodowaµ rozpadniΩcie siΩ kom≤rki, trwa│▒ infekcjΩ z powolnym uwalnianiem cz▒steczek wirusa lub infekcjΩ utajon▒ kiedy to symptomy pojawiaj▒ siΩ ze znacznym op≤╝nieniem w stosunku do czasu infekcji. Ponadto wirusy mog▒ powodowaµ powstawanie nowotwor≤w.

FIG6.36

Do tej grupy wirus≤w nale┐▒: wirus polio, hepatitis A, wirusy przeziΩbieniowe. W ma│ych wirusach RNA takich jak polio, RNA dzia│a bezpo╢rednio jako pojedyncze mRNA korzystaj▒c z translacyjnej maszynerii kom≤rkowej produkuje pojedyncz▒ d│ug▒ poliproteinΩ, kt≤ra nastΩpnie zostaje pociΩta na liczne ma│e bia│ka niezbΩdne w procesie powielania kwasu nukleinowego (polimeraza RNA) oraz powstania nowej cz▒steczki wirusa (np. bia│ka strukturalne). Synteza bia│ek kom≤rkowych zostaje zahamowana.

W tych wirusach RNA nie odgrywa bezpo╢rednio roli mRNA. Najpierw jest ono kopiowane przez RNA-zale┐n▒ polimerazΩ RNA pochodzenia wirusowego dziΩki czemu powstaje mRNA nastΩpnie wykorzystywane do syntezy bia│ek wirusowych, kt≤re prowadz▒ do replikacji genomu wirusowego i powstania nowych cz▒steczek wirusa. FIG6.39

Przyk│adem wirusa tego typu jest ludzki wirus grypy, ponadto rhabdowirusy.

W╢r≤d wirus≤w DN-owych mo┐na wyr≤┐niµ cztery g│≤wne rodziny; papovawirusy, wirusy herpes, pox i adenowirusy. Spo╢r≤d nich wszystkie poza wirusami pox przechodz▒ replikacjΩ w j▒drze kom≤rkowym, natomiast pox nietypowo powiela siΩ w cytoplazmie.

Niekt≤re wirusy z grupy papovawirus≤w maj▒ zdolno╢µ do indukowania transformacji nowotworowej kom≤rek gospodarza. Gdy wirus tego typu infekuje kom≤rkΩ, mog▒ zaj╢µ dwa typy replikacji w zale┐no╢ci od kom≤rki. W kom≤rkach pierwszego typu infekcja wirusa polega na tworzeniu nowych wirion≤w i lizie kom≤rki gospodarza. W drugim typie kom≤rek nie dochodzi do wielokrotnego powielenia wirionu, lecz DNA wirusowe integruje w genomie niekt≤rych kom≤rek prowadz▒c do genetycznej modyfikacji, kt≤ra w konsekwencji mo┐e spowodowaµ transformacjΩ kom≤rki i brak zahamowania jej wzrostu. Przyk│adem takiego wirusa jest SV40 posiadaj▒cy zdolno╢µ do indukowania nowotwor≤w w kom≤rkach zwierzΩcych FIG.6.44

Wirusy herpes s▒ du┐▒ grup▒ dsDNA wirus≤w powoduj▒cych wiele chor≤b u zwierz▒t i cz│owieka (np. ospΩ wietrzn▒), maj▒ zdolno╢µ do pozostawania w formie utajonej w kom≤rkach gospodarza, niekt≤re mog▒ prowadziµ do transformacji nowotworowej (np.wirus Epsteina-Barra).

Najbardziej skomplikowane i najwiΩksze wirusy zwierzΩce nale┐▒ do grupy wirus≤w pox. Unikatow▒ wla╢ciwo╢ci▒ tych wirus≤w jest zdolno╢µ do przeprowadzania replikacji DNA na terenie cytoplazmy kom≤rki gospodarza. Do tej grupy nale┐y wirus ospy, kt≤ry jako pierwszy zosta│ szczeg≤│owo zbadany, oraz wirus krowianki (cowpox), kt≤ry powoduje bardzo │agodn▒ i niegro╝n▒ infekcjΩ w kom≤rkach ludzkich. Wirus krowianki s│u┐y jako szczepionka przeciw ospie oraz jest u┐ywany w eksperymentach genetycznych do wprowadzania obcych gen≤w do kom≤rek zwierzΩcych i ludzkich.

Adenowirusy zosta│y po raz pierwszy wyizolowane z migda│k≤w, powoduj▒ one │agodne infekcje dr≤g oddechowych i wystΩpuj▒ czΩsto w zdrowych osobnikach.

Jedn▒ z najbardziej skomplikowanych i niew▒tpliwie najciekawszych grup wirus≤w zwierzΩcych s▒ retrowirusy. Przyczyn, dla kt≤rych znajduj▒ siΩ one w centrum zainteresowania jest wiele.

Po pierwsze, to one zosta│y pocz▒tkowo zidentyfikowane jako czynniki indukuj▒ce powstawanie nowotwor≤w. Po drugie, jeden z retrowirus≤w jest przyczyn▒ jednej z najgro╝niejszych i najbardziej kontrowersyjnych wsp≤│cze╢nie chor≤b czyli AIDS.

Ponadto mog▒ one specyficznie wintegrowywaµ w genom kom≤rki gospodarza przez po╢rednicze DNA. Proces ten jest badany pod k▒tem wprowadzania obcych gen≤w do kom≤rek w terapii genowej.

Poza tym retrowirusy posiadaj▒ enzym - odwrotn▒ transkryptazΩ, kt≤ra stosuj▒c RNA jako matrycΩ kopiuje informacje genetyczn▒ z RNA na DNA. Enzym ten jest powszechnie stosowany w in┐ynierii genetycznej. Nale┐y tutaj zaznaczyµ, ┐e odwrotna transkryptaza nie jest "narzΩdziem" zarezerwowanym wy│▒cznie dla retrowirus≤w - posiadaj▒ j▒ tak┐e retrotranspozony u Eukaryota czy E.coli.

Retrowirusy posiadaj▒ otoczkΩ o nieokre╢lonej symetrii. Genom retrowirus≤w ma bardzo nietypow▒ budowΩ. Sk│ada siΩ on z dw≤ch jednakowych pojedynczych nici RNA (+) , po│▒czonych wi▒zaniami wodorowymi poprzez parowanie nukleotyd≤w ze specyficznymi cz▒steczkami tRNA. 5' koniec RNA posiada cap natomiast 3' koniec posiada ogon poly(A) wobec czego RNA mog│oby s│u┐yµ bezpo╢rednio jako mRNA, jednak tak siΩ nie dzieje.

Og≤lnie proces replikacji retrowirus≤w zachodzi w kilku etapach. Na pocz▒tku wirus dostaje siΩ do kom≤rki, nastΩpnie jedna z nici RNA jest odwrotnie transkrybowana w ssDNA kt≤re zostaje przekszta│cone w liniowe dsDNA przez odwrotn▒ transkryptazΩ. Kolejnym etapem jest wintegrowanie powsta│ego dsDNA retrowirusa w genom kom≤rki gospodarza. Potem zachodzi transkrypcja DNA wirusowego, powstajemRNA i "potomne" wirusowe RNA, kt≤re zostaje upakowane w kapsydzie na terenie cytoplazmy. W ko±cu nowe cz▒steczki wirusa s▒ odp▒czkowywane z b│ony cytoplazmatycznej i uwalniane z kom≤rki. FIG 6.48.49.50.

Pierwszym etapem po wej╢ciu wirusa do kom≤rki jest transkrypcja RNA na DNA przy zastosowaniu odwrotnej transkryptazy. Enzym ten wykazuje kilka rodzaj≤w aktywno╢ci; synteza DNA z wykorzystaniem RNA jako matrycy (odwrotna transkryptaza), synteza DNA z wykorzystaniem DNA jako matrycy (polimeraza DNA) oraz degradowanie nici RNA w hybrydzie RNA-DNA (rybonukleaza H). Jak wszystkie polimerazy DNA enzym ten wymaga primeru do syntezy DNA.

W reakcji przeprowadzanej przez odwrotn▒ transkryptazΩ primerem jest specyficzne tRNA kom≤rkowe. Rodzaj u┐ytego tRNA jest zwi▒zany z typem wirusa i pochodzi z ostatniej kom≤rki gospodarza. Przy u┐yciu danego tRNA jako primeru oko│o 100 nukleotyd≤w RNA z

5'ko±ca jest odwrotnie transkrybowanych na DNA. Gdy transkrypcja dojdzie do 5' ko±ca, zostaje ona zatrzymana.

W celu skopiowania pozosta│ej wiΩkszo╢ci RNA stosowany jest inny mechanizm. Najpierw usuwane jest RNA ju┐ skopiowane przez RT (reverse transcriptase û odwrotna transkryptaza) dziΩki jej aktywno╢ci rybonukleazowej co powoduje pozostawienie ma│ego odcinka jednoniciowego DNA komplementarnego do 3' ko±ca RNA. Ten odcinek DNA jest transferowany na drug▒ stronΩ nici RNA i hybrydyzuje z 3' ko±cem i nastΩpnie doko±czona zostaje synteza DNA(-) na matrycy RNA.

Dzia│anie RT jako rybonukleazy prowadzi do usuniΩcia RNA z wyj▒tkiem ma│ego fragmentu, kt≤ry zostaje u┐yty jako primer do syntezy pozytywnej nici DNA. Ostatecznie zostaje utworzona dsDNA z LTR (long terminal repeats) na obu ko±cach.

LTR zawieraj▒ silne promotory transkrypcji i bior▒ udzia│ w procesie integracji, kt≤ry mo┐e zaj╢µ w dowolnym punkcie DNA kom≤rkowego. Wintegrowany fragment wirusa nazywany jest prowirusem i staje siΩ stabilnym elementem genetycznym. Prowirusowe DNA jest transkrybowane przez kom≤rkow▒ RNA polimerazΩ w RNA kt≤re zostaje opatrzone ogonem poly(A) i czapeczk▒ cap, a nastΩpnie mo┐e zostaµ upakowane w cz▒steczki wirusa lub mo┐e ulec translacji w bia│ka wirusowe.

Wiroidy s▒ to ma│e, koliste cz▒steczki jednoniciowego RNA. Wiroidy s▒ najmniejszymi znanymi patogenami w postaci kwasu nukleinowego. Cz▒steczki te atakuj▒ ro╢liny wy┐sze. Pozakom≤rkowo wystΩpuj▒ one w postaci "nagiego" RNA pozbawionego nawet kapsydu. Wiroidy nie zawieraj▒ gen≤w koduj▒cych bia│ka strukturalne i s▒ ca│kowicie zale┐ne od kom≤rki gospodarza.

Webmaster