Pierwszym udanym eksperymentem tego typu by│o wyprodukowanie ludzkiego bia│ka - somatostatyny - 14 aminokwasowego neurotransmitera peptydowego. Gen koduj▒cy somatostatynΩ zosta│ zsyntetyzowany chemicznie i sklonowany w wektorze plazmidowym eksprymowanym w E.coli. Pierwszym komercyjnym produktem by│a ludzka insulina.

Obecnie dziΩki technologii rekombinowanego DNA uzyskiwane s▒ bia│ka wykorzystywane w leczeniu szeregu chor≤b : raka , alergii , chor≤b autoimmunologicznych , neurologicznych , atakach serca , chorobach krwi , infekcjach , chorobach genetycznych.

Ca│kiem nowe podej╢cie do produkcji lek≤w wyros│o w│a╢nie z technologii rekombinacji DNA , gdy uczeni uzyskali mo┐liwo╢µ tworzenia subtelnych zmian w naturalnych bia│kach usprawniaj▒cych ich funkcjonowanie i zwiΩkszaj▒cych u┐yteczno╢µ.

Techniki i metody stosowane w in┐ynierii genetycznej wykorzystuje siΩ przy produkcji :

- szeregu enzym≤w

- biologicznie czynnych bia│ek (interferony , czynniki krzepniΩcia)

- antybiotyk≤w (penicylina , streptomycyna)

- hormon≤w (insulina , somatotropina , somatostatyna).

Ponadto znalaz│y one zastosowanie przy :

- mapowaniu chromosom≤w

- wykrywaniu mutacji punktowych np. beta-talasemii , fenyloketonurii , dystrofii miΩ╢niowej

Duchenne`a)

- wykrywaniu submikroskopowych delecji , insercji czy translokacji

- badaniu RFLP m.in. w przypadku koagulopatii , mukowiscydozy itd.

RFLP - polimorfizm d│ugo╢ci fragment≤w restrykcyjnych. Indywidualne genomy ludzkie r≤┐ni▒ siΩ miΩdzy sob▒ - wystΩpuje polimorfizm genetyczny. Odcinki DNA uzyskane po trawieniu restrykatazami s▒ charakterystyczne dla ka┐dego genomu. Uda│o siΩ w przypadku niekt≤rych chor≤b o pod│o┐u genetycznym skorelowaµ mutacjΩ powoduj▒c▒ stratΩ b▒d╝ uzyskanie miejsca restrykcyjnego z wystΩpowaniem choroby.

IN»YNIERIA GENETYCZNA W MEDYCYNIE I FARMACJI

1. Szczepionki zawieraj▒ce ┐ywe atenuowane drobnoustroje (atenuacja przez wprowadzenie do genomu ╢ci╢le okre╢lonych mutacji delecyjnych).

Przyk│ady :
- szczepionki przeciwko Salmonella typhi.

2. Szczepionki podjednostkowe :

- bia│ka rekombinacyjne - wektory pochodzenia wirusowego zrekombinowane z genami koduj▒cymi immunogenne bia│ka organizmu patogennego

- bia│ka syntetyczne.

Przyk│ady :

- nowa szczepionka antykrztu╢cowa

- fragment genu Clostridium tetani koduj▒cy domenΩ toksyny odpowiedzialn▒ za jej immunogenno╢µ sklonowano w kom≤rkach E.coli

- szczepionka przeciwko wirusowi ┐≤│taczki Hepatitis B produkowana w kom≤rkach dro┐d┐y dziΩki ekspresji antygenu otoczki wirusowej : gen bia│ka otoczki zosta│ wstawiony w wysokokopijny wektor dro┐d┐owy , wirusowe bia│ko by│o produkowane w du┐ej ilo╢ci.

3. Profilaktyka genowa tzw. III generacja szczepionek :

- podanie czystego genu - ônagieö szczepionki.

Przyk│ady :

- wstrzykniΩcie do miΩ╢ni szkieletowych DNA wirusa grypy w formie plazmidu indukuje powstanie specyficznych cytotoksycznych limfocyt≤w T.

Szczepionki otrzymane metodami rekombinacji DNA s▒ stabilne a ich stosowaniu nie towarzysz▒ niepo┐▒dane objawy , proces wytwarzania jest bezpieczny. Preparaty mo┐na stosunkowo szybko modyfikowaµ i dostosowywaµ do zmian cech patogennego organizmu.

• Choroby genetyczne spowodowane defektem w pojedynczym genie b▒d╝ wielogenowe.

Strategia wiΩkszo╢ci szczepionek nowotworowych polega na dostarczeniu antygen≤w nowotworowych wraz z odpowiednim sygna│em kostymuluj▒cym co ma na celu swoist▒ aktywacjΩ uk│adu odporno╢ciowego przeciwko kom≤rkom przerzutowym nowotworu. Powsta│a koncepcja nowej generacji szczepionek nowotworowych genetycznie modyfikowanych. Strategia polega na pobraniu i izolacji kom≤rek nowotworowych od chorego , wprowadzeniu genu czynnika immunomoduluj▒cego (cytokiny , antygeny nowotworowe itp.) , namno┐eniu in vitro i podaniu podsk≤rnym choremu lub bezpo╢rednio do guza. Jako no╢nika gen≤w u┐ywane s▒ rekombinowane wirusy , g│≤wnie retrowirusy i adenowirusy. Podejmowane s▒ pr≤by w profilaktyce g│≤wnie czerniaka z│o╢liwego , raka nerki , bia│aczki , raka p│uc i piersi.

- sondy genetyczne - diagnozowanie bez konieczno╢ci namna┐ania mikroorganizm≤w

- PCR - wykrywanie minimalnej ilo╢ci mikroorganizm≤w.

• Choroby genetyczne :

Lista chor≤b , kt≤re mo┐na obecnie rozpoznawaµ wykorzystuj▒c techniki analizy DNA obejmuje ju┐ w tej chwili dobrze ponad sto jednostek chorobowych , m.in. s▒ to : achondroplazja, hemofilia , fenyloketonuria , anemia sierpowata , talasemie , mukowiscydoza i in.

- diagnostyka prenatalna m.in. RFLP

- choroby nowotworowe.

• Nowa generacja lek≤w.

1. Insulina - pierwszy lek uzyskany technikami in┐ynierii genetycznej , kt≤ry uzyska│ licencjΩ.

Insulina u┐ywana wcze╢niej w leczeniu cukrzycy , uzyskiwana z trzustek ╢wini i kr≤w , nie by│a identyczna z ludzk▒. Dlatego te┐ niekt≤rzy pacjenci wytwarzali przeciwcia│a przeciwko temu bia│ku. Insulina stworzona dziΩki in┐ynierii genetycznej jest identyczna z ludzk▒. Eksprymowana jest w kom≤rkach E.coli. Poprzednio │a±cuchy A i B by│y produkowane oddzielnie a nastΩpnie fa│dowane w dojrza│▒ cz▒steczkΩ insuliny. Obecnie w celu produkcji komercyjnej , eksprymowane jest pojedyncze fuzyjne bia│ko , kt≤re nastΩpnie jest przecinane i w taki spos≤b uzyskuje siΩ w jednym kroku dojrza│▒ , zrekombinowan▒ insulinΩ.

2. Ludzki hormon wzrostu (hGH) - produkowany w kom≤rkach bakteryjnych na dwa sposoby. Skonstruowano wektor ekspresyjny u┐ywaj▒c cDNA koduj▒cego wiΩkszo╢µ aminokwas≤w i dodano syntetyczny oligonukleotyd pocz▒tkowy. Hormon by│ eksprymowany wewn▒trzkom≤rkowo. Drugim sposobem by│o dodanie na pocz▒tku genu sekwencji sygna│owej , kt≤ra umo┐liwi│a transport bia│ka do przestrzeni peryplazmatycznej sk▒d │atwo mo┐na by│o uwoliµ hormon za pomoc▒ dysrupcji hypotonicznej zewnΩtrznej b│ony.

3. Tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) jest produkowany komercyjnie w ssaczych kulturach kom≤rkowych. Sklonowano ludzkie cDNA tego genu , wstawiono pod silny promotor i terminator. Wektorem zosta│a stabilnie stransfekowana linia kom≤rek ssaczych. Linie wysoko eksprymuj▒ce to bia│ko hodowane s▒ w du┐ych fermentatorach a zrekombinowany tPA jest oczyszczany z po┐ywki.

4. Czynnik VIII , niezbΩdny do prawid│owego krzepniΩcia krwi , jest tak┐e produkowany przez ssacze kom≤rki. Od wielu lat hemofilitykom podawano ten czynnik oczyszczany z ludzkiej krwi. Przyczyni│o siΩ to w pewien spos≤b do rozszerzenia pandemii AIDS. Obecnie cDNA genu tego bia│ka zosta│o sklonowane. Podobnie jak tPA , czynnik VIII jest du┐ym kompleksem bia│kowym , kt≤ry prawid│owo mo┐e byµ sk│adany i produkowany tylko w kom≤rkach ssaczych.

• Somatyczna terapia genowa - genetyczne modyfikacje kom≤rek somatycznych.

Terapia genowa poprzedzona musi byµ sklonowaniem odpowiedniego genu , identyfikacj▒ jego sekwencji regulacyjnych i kom≤rek , w kt≤rych dzia│a oraz wyborem wydajnych metod ich transfekcji. Powinno siΩ tak┐e przeprowadziµ badania , kt≤re bezsprzecznie dowiod▒ , ┐e wprowadzony prawid│owy gen dzia│a zgodnie z przewidywaniami a tak┐e nie narusza metabolizmu zr≤wno kom≤rki , do kt≤rej go wprowadzono jak i ca│ego organizmu. Mo┐liwe s▒ dwa warianty terapii : albo wprowadza siΩ kilka dodatkowych kopii prawid│owego genu albo wymienia gen defektywny na prawid│owy. Metody wprowadzenia genu tak┐e s▒ dwie : albo pobiera siΩ docelowe kom≤rki z organizmu pacjenta , modyfikuje genetycznie in vitro , po czym powt≤rnie wprowadza do organizmu albo wprowadza siΩ gen bezpo╢rednio do ca│ego organizmu lub tkanki.

Trudno╢ci :

- k│opoty ze znalezieniem wydajnego systemu transfekcji kom≤rek eukariotycznych

- charakter ekspresji wprowadzonych gen≤w niestety najczΩ╢ciej jest przej╢ciowy.

Podejmuje siΩ pr≤by leczenia :

- chor≤b spowodowanych defektem w pojedynczym genie

- chor≤b wielogenowych (uk│adu kr▒┐enia , nerwowego , nowotwory)

- autoagresywnych chor≤b uk│adu odporno╢ciowego.

Przyk│ady :

- Pr≤ba wyznakowania genetycznego limfocyt≤w odseparowanych z litego guza chorego. Wprowadzono do limfocyt≤w marker (gen oporno╢ci na neomycynΩ) co pozwoli│o na ╢ledzenie ich los≤w po powt≤rnym wstrzykniΩciu , nastΩpnie po ponownym pobraniu transfekowano je in vitro genami koduj▒cymi czynnik martwicy nowotwor≤w i interleukinΩ 2.

- Pr≤ba leczenia SCID (ciΩ┐ki z│o┐ony niedob≤r immunologiczny). Do krwioobiegu wprowadzono limfocyty transfekowane wektorem retrowirusowym z prawid│owym genem. Rezultatem by│a odporno╢µ na antygeny i pojawienie siΩ przeciwcia│.

- Pr≤ba leczenia hemofilii B. Wprowadzono gen czynnika IX do hemocytoblast≤w za po╢rednictwem wektor≤w retrowirusowych.

- Pr≤ba leczenia rodzinnej hipercholesterolemii. Przy udziale wektora adenowirusowego wprowadzono gen kontroluj▒cy syntezΩ receptora LDL do hepatocyt≤w.

- Pr≤bowano tak┐e wyleczyµ niedob≤r somatotropiny przy udziale wektora retrowirusowego przenosz▒c geny do hepatocyt≤w.

Terapia genowa nie zosta│a do tej pory wprowadzona do praktyki klinicznej.

Bardzo istotnymi dla rozwoju wielu z powy┐szych zastosowa± okaza│y siΩ m.in. technologie :

• Produkcja przeciwcia│ monoklonalnych. Izoluje siΩ kom≤rki ╢ledziony myszy immunizowanej antygenem , miesza siΩ je ze zmutowanymi (niezdolnymi do wzrostu na pewnej po┐ywce) kom≤rkami lini szpiczaka (myeloma). Niekt≤re z nich ulegn▒ fuzji. Selekcjonuje siΩ je in vitro na pod│o┐u , na kt≤rym rosn▒ tylko klony hybrydowe i hoduje w studzienkach zawieraj▒cych potomstwo jednej kom≤rki. Taki klon hybrydowy bΩdzie produkowa│ przeciwcia│a o po┐▒danej specyficzno╢ci wobec r≤┐nych determinant antygenu u┐ytego do immunizacji i bΩdzie nie╢miertelny. Monoklonalne przeciwcia│a s▒ w tej chwili szeroko u┐ywane w diagnostyce infekcji i raka oraz do szeregu innych cel≤w.

• W technologii zwanej in┐ynieri▒ bia│ek u┐ywa siΩ rekombinowanego DNA w celu zmodyfikowania struktury naturalnego bia│ka aby ulepszyµ lub zmieniµ jego funkcje. Dobrym przyk│adem s▒ tutaj przeciwcia│a poniewa┐ ich potencjalne zastosowanie w medycynie jest bardzo du┐e a ich struktura jest w do╢µ znacznym stopniu poznana. Mo┐liwe s▒ zmiany ich domen efektorowych - region≤w │a±cucha ciΩ┐kiego , kt≤re wyznaczaj▒ specyficzno╢µ funkcjonowania przeciwcia│a. Obiecuj▒c▒ strategi▒ jest zast▒pienie domeny efektorowej sekwencj▒ koduj▒c▒ toksynΩ. Takie fuzyjne przeciwcia│o dostarczy toksynΩ specyficznie do kom≤rek , kt≤re posiadaj▒ docelowy antygen. Mo┐e mieµ to du┐e znaczenie w leczeniu raka lub takich wirusowych chor≤b jak np. AIDS.

R≤┐norodno╢µ nowych technologii sk│ania do zastanowienia siΩ nad praktycznie nieograniczonymi mo┐liwo╢ciami ich ingerencji , w pozytywnym tego s│owa znaczeniu , w ┐ycie wsp≤│czesnego cz│owieka.

REKOMBINOWANE DNA W MEDYCYNIE , PRZEMYªLE I FARMACJI. WSPANIAúA WIZJA PRZYSZúOªCI ?

REKOMBINOWANE DNA W PRZEMYªLE

Webmaster