BIBLIOTEKI A MO»E BANKI DNA I CO SI╩ W NICH PRZECHOWUJE.

BANK (inaczej BIBLIOTEKA) DNA - to zesp≤l fragment≤w DNA danego organizmu po│▒czonych z cz▒steczkami wektor≤w. BibliotekΩ poddaµ mo┐na screeningowi czyli przeszukaniu przy pomocy r≤┐nych metod w zale┐no╢ci od tego czym dysponujemy i czego szukamy.

Dobrze skonstruowany bank gen≤w to taki , w kt≤rym ka┐da sekwencja genomowego DNA ma swoj▒ reprezentacjΩ w postaci klonu. W przypadku gdy przy konstrukcji banku DNA mia│o szansΩ na losowe pΩkniΩcie , tak jak siΩ to dzieje np. przy fragmentacji mechanicznej , do oceny reprezentatywno╢ci bibioteki stosuje siΩ wz≤r :

N=ln(1-P)/ln[1-(I/G)]

gdzie :

N - ilo╢µ niezale┐nych klon≤w

P - prawdopodobie±stwo obecno╢ci danej sekwencji w banku (przyjmuje siΩ 99%)

I - wielko╢µ ╢redniego insertu (wstawki) w wektorze wyra┐ona w parach zasad

G - wielko╢µ genomu w parach zasad

Poniewa┐ preparat DNA pochodzi z bardzo wielu kom≤rek , ka┐dy rodzaj fragmentu zdarza siΩ w nim wielokrotnie. Wektory │▒cz▒ siΩ z fragmentami do╢µ przypadkowo. Przy tworzeniu biblioteki trzeba wykorzystaµ du┐▒ wielokrotno╢µ liczby klon≤w , kt≤re powinny byµ w niej reprezentowane. Mimo wszystko nie otrzymamy nigdy 100% pewno╢ci , ┐e ka┐da sekwencja jest w banku obecna. Obliczono , ┐e aby uzyskaµ 99% prawdopodobie±stwo reprezentacji wszystkich klon≤w w banku potrzeba wyj╢ciowej liczby oko│o 5 000 klon≤w na wektorach plazmidowych w kom≤rkach E.coli dla dro┐d┐y i 800 000 klon≤w w przypadku cz│owieka.

Wyr≤┐niamy dwa rodzaje bibliotek DNA :

BIBLIOTEKI GENOMOWE - fragmentacji poddawany jest ca│y DNA danego organizmu , │▒czy siΩ go z cz▒steczkami wektora. Po transformacji kom≤rek gospodarza banku w ka┐dej z nich znajdzie siΩ jeden wektor. Potomstwo kom≤rki wyj╢ciowej bΩdzie zawiera│o ten sam fragment czyli zostanie on namno┐ony inaczej sklonowany. Bibioteka taka jest reprezentacj▒ ca│ego DNA organizmu zar≤wno koduj▒cego (geny , egzony gen≤w) jak i niekoduj▒cego (introny , sekwencje regulatorowe , repetytywne , ruchome i inne o nie znanym znaczeniu). Ma to swoje zalety i wady. Je╢li dobrze przygotujemy tak▒ bibiotekΩ mamy bardzo du┐e szanse na znalezienie interesuj▒cego nas genu. CzΩsto zdarza siΩ tak , ┐e na ┐adnym z klon≤w nie znajdziemy ca│o╢ci genu. Dzieje siΩ tak poniewa┐ jest du┐a szansa na to , ┐e enzym u┐yty do konstrukcji banku mo┐e mieµ miejsce ciΩcia w obrΩbie interesuj▒cej nas sekwencji. Szansa ta ro╢nie wprost proporcjonalnie do jej d│ugo╢ci. Aby obej╢µ ten problem mo┐na tak dobraµ warunki trawienia by enzym nie trawi│ we wszystkich mo┐liwych miejscach co zwiΩksza szansΩ na znalezienie ca│o╢ci genu. W przypadku gdy szukanym przez nas odcinkiem DNA jest nie gen ale np. promotor , enhancer czy inna sekwencja regulacyjna bibioteka genomowa jest niezast▒piona.

BIBLIOTEKI cDNA - z kom≤rek izoluje siΩ mRNA a nastΩpnie przy u┐yciu odwrotnej transkryptazy przepisuje siΩ mRNA na DNA tworz▒c cDNA (complementary DNA - komplementarny do mRNA).

Odwrotna transkryptaza - enzym izolowany z retrowirus≤w , katalizuje reakcjΩ polimeryzacji dNTP w komplementarny │a±cuch DNA u┐ywaj▒c cz▒steczki mRNA jako matrycy. Dodane wolne oligo dT hybrydyzuj▒ z 3` ko±cem │a±cucha mRNA (poli-A) i s│u┐▒ jako starter. NastΩpnie mRNA jest usuwane przez podwy┐szenie pH (pH alkaliczne) , co powoduje hydrolizΩ RNA ale nie DNA. Jednoniciowy DNA (ssDNA) jest wyd│u┐any na 3` ko±cu dziΩki terminalnej transferazie , kt≤ra przenosi pojedyncze nukleotydy dG nie wymagaj▒c matrycy. Chemicznie zsyntetyzowany starter oligo-dC hybrydyzuje do 3` oligo-dG. NastΩpuje synteza komplemetarnego │a±cucha. Powstaje dwuniciowy DNA (dsDNA). Ligowane s▒ kr≤tkie (10-12 bp) kawa│ki dsDNA , zawieraj▒ce miejsce rozpoznawane przez konkretny enzym restrykcyjny tzw. linkery. DNA ciΩte jest t▒ restryktaz▒ (cDNA jest modyfikowane , przed przy│▒czeniem linker≤w , odpowiednim enzymem , kt≤ry metyluje specyficzne dla danej restryktazy sekwencje , aby zapobiec ciΩciu w obrΩbie cDNA). Wynikiem tych wszystkich zabieg≤w jest dwuniciowy cDNA z lepkimi ko±cami z obu stron. Potem postΩpuje siΩ podobnie jak poprzednio czyli │▒czy cDNA z cz▒steczkami wektora przeciΩtego t▒ sam▒ restryktaz▒ i wprowadza do kom≤rek gospodarza banku gdzie ulegn▒ namno┐eniu.

Wady : nale┐y pamiΩtaµ , ┐e w ten spos≤b uzyskujemy bibliotekΩ tylko tych gen≤w , kt≤re s▒ w danym momencie i w danej tkance aktywne transkrypcyjnie , dlatego nale┐y dobrze przemy╢leµ wyb≤r tkanki i czas izolacji. Takiego problemu nie ma gdy poszukiwany gen jest genem podstawowym i we wszystkich tkankach ulega ekspresji. Inn▒ wad▒ jest reprezentacja w r≤┐nych ilo╢ciach kopii r≤┐nych odcink≤w cDNA poniewa┐ nie we wszystkich kom≤rkach transkrypty danego genu bΩd▒ wystΩpowa│y tak samo licznie.

Zalet▒ takiego banku jest pewno╢µ , ┐e ka┐da cz▒steczka cDNA zawiera informacjΩ genetyczn▒ odpowiadaj▒c▒ dok│adnie jednemu genowi czyli ka┐dy klon to jeden ca│y gen. Inn▒ korzy╢ci▒ jest fakt braku intron≤w co mo┐na wykorzystaµ kiedy chcemy produkowaµ dane bia│ko w kom≤rkach bakterii , kt≤ra normalnie nie przeprowadza splicingu.

BIOTECHNOLOGIA , IN»YNIERIA GENETYCZNA - CO TO TAKIEGO ?

ENZYMY , KT╙RE TNí DNA NA FRAGMENTY...

Webmaster