Darmowa prenumerata - tu i teraz!
BezImienny - wersja online!
Encyklopedia Zjawisk Paranormalnych 2.0
Poprzedni artykułNastępny artykuł Nauka  

Genetyk amator


Grzegorz Gałęzowski

Nadanie genom zwierząt czy roślin pożądanych cech może nastręczać pewne trudności, natomiast genetyczna manipulacja materiałem bakteryjnym jest stosunkowo prosta. Postępując zgodnie z instrukcją możesz wprowadzić odporność bakterii na antybiotyki.

Po przeczytaniu poniższego tekstu zobaczycie jak łatwo można manipulować genami bakterii. Opis ten będzie dotyczył bakterii Escherichia coli, które występują w organizmie człowieka prawie od urodzenia.

Należy pamiętać o zachowaniu sterylności podczas trwania całego doświadczenia, i uważać by nie połknąć próbki.

Do wykonania eksperymentu będą potrzebne:

Zestaw do łączenia genów, rekombinacji i transformacji DNA, zestaw PN # 21-1160 można zamówić pod adresem:
Carolina Biological Supply Company
2700 York Road, Burlington, NC 27215 (910) 584-0381
cena 35.67 dolarów USA


Zawartość:
- Jedna probówka z plazmidem pAMP
- Jedna probówka z plazmidem pKAN
- Hodowla E. coli
- Trzy płytki LB
- Dwie płytki LB/AMP
- Dwie płytki LB/KAN
- Dwie płytki LB/AMP/KAN
- Trzy probówki mieszaniny ligacyjnej
- Jedna probówka z chlorkiem wapnia
- Dwanaście mikropipet
- Osiemnaście jednomilitrowych sterylnych pipet
- Cztery piętnastomilitrowe probówki
- Pięć sterylnych ez
- Szklana głaszczka
- Instrukcja


Dodatkowe wyposażenie - Palnik alkoholowy lub Bunsena
- Mydło antybakteryjne
- Akwarium lub pudełko
- Zlewki lub miski (dwie)
- Lód
- Woda destylowana
- Alkohol etylowy (70 do 95 procent)
- Pisak do szkła
- Środek odkażający
- Kawałek folii do zakrycia akwarium
- Termometr


Zaczynamy:

Najpierw musimy zbudować inkubator do hodowli kolonii E. coli. Rolę tę spełni 80-litrowe szklane akwarium lub jakikolwiek pojemnik podobnej objętości, na przykład tekturowe pudło. Ustaw akwarium na boku otworem do przodu i przyklej taśmą kawałek folii do jego górnej krawędzi tak, by opadając tworzyła rodzaj kurtyny. Ułatwi to pracę wewnątrz naszego inkubatora.

Optymalna temperatura wzrostu E. coli wynosi 37 C, co nie jest zaskoczeniem, jeśli znamy naturalne środowisko tych bakterii, m. in. organizm człowieka. Aby ogrzać inkubator, umieść w nim standardową żarówkę osłoniętą puszką. Zacznij od żarówki 40 W i mierz temperaturę w inkubatorze po 12-24 godzinach; jeśli to konieczne, zwiększaj moc żarówki. Jeśli temperatura przekracza 37 C, zastosuj słabszą - lepiej, żeby było trochę za chłodno niż za ciepło. Jeśli zmiana żarówki nie zda egzaminu, zainstaluj ściemniacz regulujący moc lampy, a zatem i temperaturę.

Inkubator należy przygotować przed nadejściem przesyłki z zestawem do rekombinacji. Gdy otrzymasz zestaw, płytki do kultury bakteryjnej włóż do lodówki przykrywką do dołu, probówki zawierające plazmidy pAMP, pKAN i chlorek wapnia (potrzebny do zrobienia komórek kompetentnych) również w niej umieść. Probówkę zawierającą ligazę/bufor ligacyjny/ ATP włóż do zamrażarki. Pozostałe materiały można przechowywać w temperaturze pokojowej. Tuż przed rozpoczęciem doświadczenia przetrzyj inkubator i powierzchnię przeznaczoną do pracy jakimś środkiem odkażającym, może to być bielinka (Clorox) rozcieńczona wodą 1:9 lub lizol. Zdezynfekuj miejsce pracy po każdej serii doświadczenia nie zapominając o umyciu rąk mydłem antybakteryjnym przed i po każdym doświadczeniu. Zawsze należy miejsce pracy pozostawić czyste i zdezynfekowane, natomiast całe wyposażenie - probówki, pipety, ezy - po użyciu umieszczać w odkażającym płynie.

Następnym zadaniem jest inkubacja i hodowla bakterii E. coli na płytce. Płytki do hodowli zawierają podłoże bulionowe Lurii (LB) ze składnikami odżywczymi niezbędnymi do wzrostu bakterii. Kolonie E. coli wykorzystamy w dalszej części doświadczenia. Zapal palnik alkoholowy lub Bunsena. Weź jedną płytkę oznaczoną LB i napisz na jej denku "E. coli" oraz datę.

W płomieniu palnika rozgrzej ezę do czerwoności, po czym trzymaj poza ogniem przez kilka sekund, aby ostygła. Nie odkładaj jej, bo się rozjałowi. Probówkę z hodowlą E. coli weź do drugiej ręki i odkorkuj ją małym palcem ręki, w której trzymasz ezę. Górną część probówki przesuń nad płomieniem, by ją wysterylizować.

Unieść wieczko płytki LB oznaczonej "E. coli" na tyle, aby wysunąć ezę. Wystudź ezę dotykając ja do brzegu agaru znajdującego się na płytce. Następnie zanurz oczko ezy kilka razy w hodowli E. coli w probówce. Ezę z kroplą hodowli wyjmij z probówki, której otwór ponownie opal w płomieniu i zakorkuj.

Dotknij ezą powierzchni płytki i wykonuj nią ruchy zygzakowate na jednej ćwiartce płytki. Zamknij wieczko. Obróć płytkę o 90 stopni, ponownie rozgrzej ezę i ostudź ją w agarze z dala od pierwszego posiewu. Następnie przesuń ezę raz poprzez linie pierwszego posiewu i wykonaj posiew w drugiej ćwiartce w taki sam sposób jak w pierwszej. Powtórz obracanie płytki, opalanie ezy i posiew jeszcze dwa razy. W rezultacie uzyskasz cztery zygzakowate posiewy w każdej ćwiartce płytki. Przykryj płytkę wieczkiem.

Opal ezę przed odłożeniem jej, aby nie skazić miejsca pracy. Takie postępowanie powinno ci wejść w nawyk. Włóż posianą płytkę do inkubatora wieczkiem do dołu, aby kolonii E. coli, które będą na niej wyrastać, nie zalewała woda skraplająca się na wieczku podczas inkubacji. Płytki należy inkubować nie dłużej niż 12-24 godziny. Po tym czasie wyjmij płytki z inkubatora i pozwól koloniom podrosnąć w temperaturze pokojowej przez jeden lub dwa dni.

Następnym etapem jest połączenie fragmentów DNA zawierających geny oporności na antybiotyki z DNA plazmidowym E. coli. W probówkach pAMP i pKAN znajdują się zarówno wskazane fragmenty DNA, jak i plazmidy; białko zwane ligazą połączy fragmenty DNA i zamknie kółko plazmidu (ATP w mieszaninie ligacyjnej dostarcza energii do reakcji łączenia). Procedura ta prowadzi do powstania wielu różnych typów hybrydowych cząsteczek, jednak tylko prawidłowo uformowane mają szansę być wyrażane w komórkach.

Weź z lodówki trzy probówki, z których każda zawiera 20 mikrolitrów mieszaniny ligaza/bufor ligacyjny/ATP. Oznacz jedną probówkę "+pAMP/KAN", drugą "+pAMP" i ostatnią "+pKAN". Używając do każdego ze składników sterylnej mikropipety - dodaj 10 mikrolitrów pAMP i 10 mikrolitrów pKAN do probówki +pAMP/KAN i 10 mikrolitrów pKAN do probówki +pAMP/KAN; 10 mikrolitrów pAMP i 10 mikrolitrów wody desytlowanej do probówki +pAMP; oraz 10 mikrolitrów pKAN i 10 mikrolitrów wody destylowanej do probówki +pKAN. Zatkaj probówki i delikatnie postukaj ich dnem w stół, aby wymieszać składniki. Inkubuj probówki w temperaturze pokojowej przez 12-24 godziny. Po inkubacji w probówce +pAMP/pKAN powstały plazmidy niosące oporność na oba antybiotyki - ampicylinę i kanamycynę, w probówce +pAMP plazmidy z opornością na ampicylinę i kanamycynę, w probówce +pAMP plazmidy z opornością na ampicylinę, a w probówce +pKAN jedynie z opornością na kanamycynę.;

Teraz musimy przygotować komórki "kompetentne" E. coli, które wchłoną zrekombinowane plazmidy. Wymaga to zawieszenia komórek E,. coli w zimnym roztworze chlorku wapnia i poddania ich krótkotrwałemu szokowi temperaturowemu w 42 C.

Przygotuj łaźnie wodną, by przeprowadzić szok termiczny; skorzystasz z niej raz przez 90 sekund. Możesz zastosować podgrzewacz akwaryjny, aby podnieść temperaturę wody w jakimś naczyniu do około 42 C (parostopniowa dokładność wystarczy). Odpowiednią temperaturę można również uzyskać za pomocą bieżącej wody.

Weź cztery sterylne 15-mililitrowe probówki. Oznacz je "+pAMP/KAN", "-pAMP/KAN", "+pAMP" i "+pKAN". Sterylną pipetą dodaj do każdej probówki 250 mikrolitrów zimnego chlorku wapnia. Umieść probówki w kubełku z pokruszonym lodem. Sterylną, plastikową ezą pobierz jedną lub dwie kolonie E. coli z płytki wyjściowej. Staraj się, aby wraz z kolonią nie zebrać agaru z płytki. Zanurz ezę w roztworze chlorku wapnia w probówce +pAMP/KAN i postukuj nią o szklaną ściankę, aby masa komórkowa została w probówce. W celu dokładnego zawieszenia komórek wciągnij kilkakrotnie roztwór do pipety. Włóż z powrotem probówkę +pAMP/KAN do lodu. W ten sam sposób przygotuj zawiesinę komórek w pozostałych trzech probówkach.

W każdym z następnych etapów użyj świeżej mikropipety. Przenieś 10 mikrolitrów zligowanego plazmidu +pAMP/KAN z odpowiedniej probówki hodowlanej +pAMP/KAN. Dodaj 10 zligowanego +pAMP do probówki hodowlanej +pAMP i 10 mikrolitrów zligowanego +pKAN do probówki +pKAN. Do probówki hodowlanej -pAMP/KAN nie dodawaj niczego; powinna ona zawierać jedynie nie zmienione bakterie E. coli. Ponownie umieść probówki w lodzie i pozostaw przez 15 minut.

Po inkubacji w lodzie nadszedł czas na szok temperaturowy. Wszystkie probówki wyjmij z lodu i natychmiast zanurz w łaźni z lodu i natychmiast zanurz w łaźni wodnej o temperaturze 42 C. Po 90 sekundach inkubacji ponownie wstaw probówki do lodu na 3-4 minuty.

Używają sterylnej pipety dodaj do każdej probówki po 250 mikrolitrów bulionu Lurii, by nakarmić swoje bakterie. Delikatnie popukaj palcem w każdą probówkę, aby wymieszać jej zawartość, a następnie inkubuj je przez 3-6 godzin w temperaturze 37 C. Przy odrobinie szczęścia komórki E. coli będą zdolne wchłonąć plazmidy znajdujące się wokół nich.

Teraz możesz sprawdzić, czy E. coli rzeczywiście nabyła oporności na ampicylinę i kanamycynę. Niektóre płytki w zestawie już zawierają antybiotyki gotowe do walki z naszą E. coli; płytki te są odpowiednio opisane. Oznaczone "LB" zawierają tylko bulion Lurii; "+LB", i "-LB" wskazują, że na tych płytkach będziemy hodować odpowiednio zmienione i nie zmienione E. coli. Oznacz jedną płytkę LB/AMP/KAN jako "+pAMP/KAN" - na tej płytce zawierającej oba antybiotyki, ampicylinę i kanamycynę, wysiejemy komórki E. coli oporne na obydwa. Oznacz następną płytkę LB/AMP/KAN jako "-pAMP/KAN" - tutaj posiejemy tylko te nie zmienione bakterie E. coli. Oznacz jedną płytkę LB/AMP jako "+pAMP", a drugą jako "+pKAN" - na tych (zawierających ampicylinę) płytkach będziemy wysiewać E. coli oporne na ampicylinę (pierwsza płytka) i kanamycynę (druga płytka). Oznacz jedną płytkę LB/KAN jako "+pKAN", a drugą jako "+pAMP".

Za pomocą sterylnej pipety pobierz 100 mikrolitrów zawiesiny komórek z probówki -pAMP/KAN i przenieś na płytkę -LB oraz -LB/AMP/KAN. Zanim rozprowadzisz zawiesinę na powierzchni agaru, wysterylizuj szklaną głaszczkę zanurzając ją w alkoholu etylowym i opalając w palniku Bunsena lub płomieniu lampki alkoholowej. Po tym głaszczka jest gotowa do dokładnego rozprowadzenia komórek E. coli na powierzchni agaru.

Inną sterylną pipetą - używaj osobnej pipety do każdej hodowli - pobierz po 100 mikrolitrów hodowli z probówki +pAMP/KAN i przenieś na płytkę +LB oraz +LB/AMP/KAN. Rozprowadź zawiesinę komórek na powierzchni agaru jak poprzednio, za każdym razem sterylizując głaszczkę. Z probówki +pAMP pobierz dwa razy po 100 mikrolitrów i rozprowadź na płytkach +pAMP i +pKAN. Również z probówki +pKAN pobierz dwa razy po 100 mikrolitrów zawiesiny bakterii i rozprowadź na płytkach +pAMP i +pKAN. Pozostaw płytki przez 10 minut na stole, następnie połącz taśmą i wstaw do inkubatora o temperaturze 37 C odwrócone wieczkami do dołu. Inkubuj je przez 12-24 godziny. Pamiętaj, że zbyt długo inkubowane kolonie nie przyrastają i trudno je wyróżnić.

A teraz pora obejrzeć wyniki doświadczenia. Na płytkach +LB i -LB dobrze rosną zarówno transformowane, jak i wyjściowe komórki E. coli. Na płytkach LB/AMP/KAN zawierających oba antybiotyki, ampicylinę i kanamycynę, zaobserwujesz wzrost jedynie na oznaczonej "+AMP/KAN". Brak wzrostu na płytce "-AMP/KAN" świadczy o tym, że tylko E. coli transformowana obydwoma genami może wyrosnąć na płytce LB/AMP/KAN. Wzrost na płytkach LB/AMP potwierdza fakt, że gen oporności pAMP, a nie pKAN niesie oporność na ampicylinę. Podobnie wzrost na płytkach LB/KAN świadczy o tym, że gen oporności pKAN, a nie pAMP determinuje oporność na kanmycynę.

Licząc kolonie, które wyrosły na płytkach zawierających antybiotyki, możesz stwierdzić bez żadnych wątpliwości, że ligacja dwóch genów pAMP i pKAN jest trudniejsza niż ligacja pojedyncza: kolonii +pAMP/+pKAN jest znacznie mniej (5 do 50) niż +pAMP lub +pKAN. Również ligacja genu pKAN jest trudniejsza (50 do 500 kolonii) niż genu pAMP (100 do 1000 kolonii).

Teraz, gdy otrzymałeś już genetycznie zmienione bakterie, musicie stwierdzić, że nie było to trudne. Każdy dysponując odpowiednimi zestawami może sobie mutować dowolne bakterie.

Dane na podstawie Scientific American.

Czekam na komentarze ze strony czytelników

UWAGA: Eschderichia coli - powoduje infekcje układu moczowego, posocznicę, biegunki i niewydolność nerek; niektóre szczepy wywołujące zakażenie dróg moczowych są wielooporne. Wywołuje infekcje szpitalne i pozaszpitalne. W latach sześćdziesiątych bakterie te stały się poważnym problemem w leczeniu chorych.


Grzegorz Gałęzowski
poczta: gsgalezowski@poczta.onet.pl